敲低hnRNP H基因?qū)ψ訉m內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響及意義

趙向寨 盧慶玲 郭 影 王 璟

(河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院，河北 石家莊 050010)

子宮內(nèi)膜癌是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的一組上皮性惡性腫瘤，是女性生殖道三大惡性腫瘤之一〔1〕。核不均一核糖體蛋白H(hnRNP H)是hnRNPs家族成員。hnRNPs家族參與mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝、剪切、表達(dá)等體內(nèi)多種調(diào)節(jié)過程〔2〕。肺癌、胰腺癌、妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤〔3～6〕等多種腫瘤研究相關(guān)報(bào)道提示，hnRNP A2/B1、hnRNP H和hnRNP K與腫瘤轉(zhuǎn)移正相關(guān)。本研究采用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建靶向hnRNP H-1，干擾RNA(siRNA)，轉(zhuǎn)染子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞，敲低hnRNP H基因表達(dá)，探討其對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期的影響，旨在為子宮內(nèi)膜癌基因治療尋找靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1材料 人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株(Ishikawa)購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購自GIBCO公司；hnRNP H siRNA、Control siRNA-A、siRNA轉(zhuǎn)染試劑購自Santa Cruz公司；hnRNP H、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、細(xì)胞周期蛋白依賴蛋白激酶(CDK4)及細(xì)胞周期蛋白(CyclinD1)抗體均購自Santa Cruz公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞株由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供，細(xì)胞經(jīng)10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，37℃、5%CO2飽和度和濕度恒溫培養(yǎng)箱中孵育。0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞傳代，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞。胰酶消化細(xì)胞計(jì)數(shù)，稀釋細(xì)胞，使得細(xì)胞密度為4×105個(gè)/ml，鋪于無菌6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)12 h至Ishikawa細(xì)胞融合率達(dá)50%，棄去原細(xì)胞培養(yǎng)液，換無血清DMEM培養(yǎng)液，按轉(zhuǎn)染試劑盒說明書要求用Transfection regent稀釋hnRNP H siRNA、Control siRNA及轉(zhuǎn)染試劑Transfection medium/regent。實(shí)驗(yàn)分組：正常培養(yǎng)Ishikawa細(xì)胞組(control)、轉(zhuǎn)染hnRNP H siRNA細(xì)胞組、轉(zhuǎn)染Control siRNA細(xì)胞株(Mock組)。轉(zhuǎn)染試劑作用6 h，無血清培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞，換含10%血清、抗生素培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。于轉(zhuǎn)染24 h后，分別搜集細(xì)胞提取總RNA及總蛋白待測(cè)。

1.3實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各蛋白 mRNA水平表達(dá) 轉(zhuǎn)染后24 h，提取總RNA，測(cè)定A260/A280值介于1.8～2.0間。以肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參，總RNA 濃度為1 mg/ml進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，將cDNA為模版進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 10 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，目的基因30個(gè)循環(huán)，內(nèi)參循環(huán)數(shù)設(shè)定為25循環(huán)。擴(kuò)增完畢，溶解曲線進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)參，利用CT值計(jì)算各組hnRNP H mRNA相對(duì)值。用2-△△CT表示。各目的基因引物序列-hnRNP H：5′-TGCCAAATATGAATAACGACCCA-3′，5′-GAGAAAAGTGCTCGTCACTGT-3′；PCNA: 5′-AAACTAGCTAGACTTTCCTC-3′ ，5′-TCACGGCCATGGCCAGGTTG-3′，CDK4:5′-CTGTGGACATGTGGAGTGTTG-3′和5′-GGCAGAGATTCGCTTGTGTG-3′,CyclinD1:5′-CTGTCCTACTACCGCCTCAC-3′和5′-CACCTCCTCCTCCTCCTCTT-3′內(nèi)參引物序列5′-GGTCCTACGTTCACCAACACA -3′，5′- CTCTGGGTCACATGGCTCT -3′。

1.4Western印跡法檢測(cè)各目的基因蛋白水平表達(dá) 轉(zhuǎn)染24 h后，提取各組細(xì)胞，預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，于冰上進(jìn)行操作，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量，各組取等量細(xì)胞總蛋白于12%+二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白，半干法轉(zhuǎn)至硝酸纖維素(NC)膜，含5%脫脂奶粉Tris鹽酸鹽緩沖液(TBS)室溫封閉1 h， hnRNP H(鼠抗1∶200，SANTA CRUZ)PCNA(鼠抗1∶500，SANTA CRUZ)、CDK4(兔抗1∶500，SANTA CRUZ)、CyclinD1(兔抗1∶500，SANTA CRUZ)和GAPDH(兔抗1∶2 000，Abcam)，4℃過夜；二抗(羊抗鼠或羊抗兔1∶5 000)37℃ 1.5 h；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色 ，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。

1.5四甲基偶氮唑藍(lán)比色法(MTT)檢測(cè)細(xì)胞存活率 將呈對(duì)數(shù)期生長的子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞計(jì)數(shù)，以5×103/ml，每孔100 μl接種于96孔板，于37℃、5%CO2恒溫?zé)o菌培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，12 h細(xì)胞融合達(dá)70%，各組細(xì)胞按上述分組干預(yù)，各設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入濃度為5 mg/ml MTT 10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液后每孔加入二甲基亞砜150 μl，微量振蕩器震蕩30 min，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光度A值(A570)，及細(xì)胞存活率。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。兩組均數(shù)比較采用成組設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，分析時(shí)間濃度效應(yīng)采用析因涉及的方差分析。

2 結(jié) 果

2.1hnRNP H siRNA轉(zhuǎn)染后目的基因在蛋白及mRNA水平的表達(dá) Control組設(shè)為1，轉(zhuǎn)染hnRNP H siRNA 24 h后hnRNP H 蛋白(0.170±0.053)表達(dá)明顯降低約為Mock組(0.985±0.026)的(17±5.3)% ，轉(zhuǎn)染hnRNP H siRNA 24 h后hnRNP H 表達(dá)在mRNA水平(0.210±0.032)明顯降低約為Mock組(0.993±0.024)的(21±3.2)%。見圖1。

2.2hnRNP H siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖及周期相關(guān)蛋白在蛋白及mRNA水平的表達(dá) 結(jié)果所示轉(zhuǎn)染hnRNP H siRNA 24 h后增殖及周期相關(guān)蛋白PCNA，CDK4及CyclinD1 表達(dá)明顯降低分別約為對(duì)照組的(70±2.1)%，(61±1.9)%，(30±5.4)%，見圖2。轉(zhuǎn)染hnRNP H siRNA 24 h后增殖及周期相關(guān)蛋白PCNA，CDK4及CyclinD1 表達(dá)在mRNA水平明顯降低結(jié)果以2-△△CT表示分別為 0.79±0.121，0.57±0.004，0.23±0.106(圖3)。

圖2 hnRNP H siRNA轉(zhuǎn)染后PCNA、CDK4、Cyclin D1在蛋白水平的表達(dá)

2.3hnRNP H siRNA轉(zhuǎn)染后24 h對(duì)細(xì)胞存活率的影響 Control組設(shè)為1，轉(zhuǎn)染hnRNP H siRNA 24 h后細(xì)胞存活率(0.560±0.054)顯著降低，約為Mock組(0.987±0.017)的 (56±5.4)%。

圖3 hnRNP H siRNA轉(zhuǎn)染后PCNA、CDK4、Cyclin D1在mRNA水平的表達(dá)

3 討 論

子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病原因不明，hnRNPs是一族高度保守的核蛋白家族，同RNA多聚酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的hnRNP顆粒密切相關(guān)，參與DNA、RNA、miRNA等多種生物行為。尤其影響哺乳動(dòng)物的主要基因表達(dá)，家族成員與選擇性轉(zhuǎn)錄剪切、翻譯后修飾相關(guān)，其中研究較多的是hnRNP A/B亞家族，多種癌癥相關(guān)研究中均有其不同作用。目前相關(guān)報(bào)道，hnRNP F/H亞家族與hnRNP A/B亞家族功能相似〔7〕。hnRNP H在肝癌、胰腺癌、喉癌中均被證實(shí)過表達(dá)〔8,9〕，但國內(nèi)外報(bào)道中較少文獻(xiàn)涉及子宮內(nèi)膜癌。本系列研究已證實(shí)子宮內(nèi)膜癌組織及Ishikawa細(xì)胞檢測(cè)hnRNP H過表達(dá)，現(xiàn)通過干擾RNA技術(shù)轉(zhuǎn)染至子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞，敲低hnRNP H基因表達(dá)，轉(zhuǎn)染hnRNP H siRNA 24 h后hnRNP H 蛋白表達(dá)明顯降低MTT檢測(cè)對(duì)照組、陰性對(duì)照組、siRNA組細(xì)胞存活率，Western印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染hnRNP H siRNA 24 h后增殖及周期相關(guān)蛋白PCNA、CDK4及CyclinD1 表達(dá)明顯降低，且在mRNA水平也明顯降低。增殖細(xì)胞核抗原具有DNA多聚酶輔助因子的功能，是細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，反映細(xì)胞增殖程度，表明PCNA過度表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖呈正相關(guān)，參與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲作用，沉默hnRNP H基因檢測(cè)PCNA蛋白表達(dá)下降，提示敲低hnRNP H基因能有效抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲能力。CDKs調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化，與其調(diào)控結(jié)合蛋白(Cyclin)發(fā)生異常時(shí)，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，表現(xiàn)為細(xì)胞增殖異常、分化調(diào)控異常〔10〕。本研究結(jié)果表明CDK4、CyclinD1過度表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌惡性轉(zhuǎn)化及侵襲行為呈正相關(guān)〔11〕，沉默hnRNP H基因檢測(cè)CDK4、Cyclin D1蛋白明顯低于未轉(zhuǎn)染組，說明敲低hnRNP H基因可阻滯細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化，抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控。

綜上所述，沉默hnRNP H基因能有效抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲能力，阻滯腫瘤細(xì)胞向S期轉(zhuǎn)化，hnRNP H基因可能成為子宮內(nèi)膜癌基因治療的潛在靶點(diǎn)。

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