民族藥復方美登木片微生物限度檢查結果與分析

1.普洱市民族傳統醫藥研究所,云南 普洱 665000;2.普洱市食品藥品檢驗所,云南 普洱 665000

民族藥復方美登木片微生物限度檢查結果與分析

付開聰1趙琪忠2

1.普洱市民族傳統醫藥研究所,云南 普洱 665000;2.普洱市食品藥品檢驗所,云南 普洱 665000

微生物限度檢查是用于判斷非規定滅菌制劑及原料、輔料是否符合藥典規定和指導研發制劑、原料、輔料微生物質量標準的依據。筆者就民族藥復方美登木片研發過程中微生物限度檢查驗證的結果作一分析,以供同行參考。

傣族拉祜族藥;復方美登木片;微生物限度檢查

復方美登木片是普洱市民族傳統醫藥研究所在挖掘整理民族民間醫藥過程中，篩選出來的民族藥驗方。源于傣族方記《檔哈雅帕雅摩雅召片領景帕罕》(傣族宮庭內土司醫生扎康郎香的醫書——宮廷秘方集)，應用歷史達500多年(此書未整理出版)。經臨床觀察與驗證，此方具有軟堅散結，消腫止痛的功效。目前，已成當地百姓及患者用于治療乳腺小葉增生、前列腺增生及癌癥化療后的輔助用藥。此藥不僅療效較好，成本低廉，而且來自于民間，起源于古代，深得百姓、患者和醫生的親睞，值得深入研究。

1 復方美登木片微生物限度檢驗方法步驟

1.1 陽性對照菌液的制備

1.1.1 試驗菌種 大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]

枯草芽孢桿菌(Bacilus subtilis)[CMCC(B)63501]

白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]

1.1.2 對照菌液 上述陽性菌分別接種于相應培養基中培養一定時間，取培養物用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋成每1ml含菌數約為50～100cfu的陽性對照菌液備用。

1.2 細菌計數方法驗證(常規法)

1.2.1 陽性對照菌液組 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌,、枯草芽孢桿菌對照液分別注入平皿(每種2個平皿)，傾注培養基培養后計數，結果見表1。

1.2.2 供試品組 取復方美登木片(批號：090401)1∶10、1∶100、1∶1000的供試液各1ml 分別注入平皿(每個稀釋級2個平皿)傾注培養基培養后計數。結果見表1。

1.2.3 試驗組(供試品加陽性對照菌液組) 取復方美登木片(批號：090401)1∶10、1∶100、1∶1000的供試液各1ml 分別注入平皿(每個稀釋級2個平皿)分別加入大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌對照菌液1ml，傾注培養基培養后計數。結果見表1。

2 霉菌及酵母菌計數方法的驗證(常規法)

2.1 陽性對照菌液組 取白色念珠菌液各1ml分別注入平皿(2個平皿)，傾注培養基培養后計數，結果見表1。

2.2 供試品組 取復方美登木片(批號：090401)1∶10、1∶100、1∶1000的供試液各1ml 分別注入平皿(每個稀釋級2個平皿)傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，混勻后25℃培養72h,計數，結果見表1。

2.3 試驗組(供試品加陽性對照菌液組) 取復方美登木片(批號：090401)1∶10、1∶100、1∶1000的供試液各1ml 分別注入平皿(每個稀釋級2個平皿)分別加入白色念珠菌對照菌液1ml，傾注培養基培養后計數。結果見表1。

表1 復方美登木片細菌、霉菌及酵母菌計數方法驗證表(常規法)

回收率(%)=(實驗組平均菌落數-供試品對照組平均菌落數)÷菌液組的平均菌落數(%)

3 細菌、霉菌及酵母菌計數法的驗證(培養基稀釋法)

通過以上對細菌、霉菌及酵母菌計數法(常規法)的驗證，可看出1∶10、1∶100、1∶1000的供試液對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌均有抑菌作用，但通過稀釋就可以降低抑菌活性，故擬先用培養基稀釋法，并對該法進行方法學驗證。

3.1 陽性對照菌液制備

3.1.1 試驗菌種 大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]

枯草芽孢桿菌(Bacilus subtilis)[CMCC(B)63501]

白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]

3.1.2 對照菌液 取經30～35℃培養18～24h的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌與枯草芽孢桿菌肉湯液體培養物1ml加入9ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10-5～10-7約為50～100cfu/ml備用。

取經23～28℃培養24～48h的白色念珠菌霉菌液體培養物1ml，加入9ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10-5～10-7約為50～100cfu/ml備用。

3.2 陽性對照菌液組 取對照菌液各1ml，分別注入平皿(5個平皿)，傾注培養基培養后計數，結果見表2。

表2-1 細菌、霉菌及酵母菌計數方法驗證表(培養基稀釋法)(批號：090401)

3.2.1 供試品組 取1∶1000的供試液1ml等量分別注入5個平皿(每平皿0.2ml)，傾注肉湯瓊脂培養基34℃培養48h后計數，結果見表2。

3.2.3 試驗組(供試品組加陽性菌液組) 取1∶1000供試液1ml等量分別注入5個平皿(每平皿0.2ml),共3個批次，分別加入大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌對照菌液各1ml，傾注肉湯瓊脂培養基，培養48h，計數，結果見表2。

表2-2 細菌、霉菌及酵母菌計數方法驗證表(培養基稀釋法)(批號：090402)

表2-3 細菌、霉菌及酵母菌計數方法驗證表(培養基稀釋法)(批號：090403)

從以上結果看出稀釋法消除了本品對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的抑菌作用，可采用此方法對復方美登木片進行微生物限度的細菌數檢查。

3.3 控制菌檢查方法的驗證 取本品10g，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成1∶10的供試液備用。

3.4 陽性對照菌液的制備

3.4.1 實驗菌種 大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]

3.4.2 對照菌液 取經30～35℃培養18～24h的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌1ml加入9ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10-5～10-7約為50～100cfu/ml備用。

表3 對照菌液計數

3.5 大腸埃希菌檢查法的驗證(培養基稀釋法)

3.5.1 試驗組 取以上1∶10的供試液10ml加入100ml無菌膽鹽乳糖培養基中,加入大腸埃希菌對照菌液1ml培養后取該培養物做MUG及靛基質試驗。結果均為陰性，未檢出大腸埃希菌。

3.5.2 陰性菌對照組 取以上1∶10的供試液10ml加入100ml無菌膽鹽乳糖培養基中,加入金黃色葡萄球菌對照菌液1ml培養后取該培養物做MUG及靛基質試驗。結果均為陰性，未檢出陰性對照菌。

3.5.3 供試品組 取以上1∶10的供試液10ml加入100ml無菌膽鹽乳糖培養基中培養后取該培養物做MUG及靛基質試驗。結果均為陰性，未檢出大腸埃希菌。

3.5.4 試驗組 取以上1∶1000的供試液2ml加入100ml無菌膽鹽乳糖培養基中,加入大腸埃希菌對照菌液1ml培養后取該培養物做MUG及靛基質試驗。結果均為陽性，檢出大腸埃希菌。

4 結果分析與建議

在中藥制劑生產過程中，原料本身是帶菌者，而且生產周期長，處理繁鎖，又增加了染菌的機會，中成藥中含糖、淀粉、微量元素等營養成份較多，為微生物生長提供了有利條件。因此藥品的染菌并非偶然，只有在取得相應的預防性措施之后，才能減少或避免污染。

生產單位及生產部門應加強對藥品受微生物污染的危害性及控制藥品微生物限度重要性的認識和學習，切實改善措施嚴格控制生產品質量；加強原料藥及輔料的合理處理和滅菌，特別是含生藥原粉的制劑更應加強處理，美登木生產中就有重樓以生婁入藥，在投原料前應進行逐項檢查驗收，防止蟲蛀、霉變、腐爛原料進入生產；滅菌處理應根據藥物有效成份的穩定性嚴格控制溫度及時間；重視配料容器、用具及包裝材料的處理(消毒或滅菌)，已潔凈的應有預防再污染的方法及措施；提高工作人員的素質，加強無菌觀念，工作中嚴格遵守操作規程，養成良好的衛生習慣；健全質量檢驗機制，嚴格遵守檢驗程序，半成品檢驗不合格的，決不流到下一工序；成品檢驗不合格，決不出廠；改善倉儲條件及運輸條件，嚴防成品的再污染。

R29

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1007-8517(2014)20-0014-03

2014.09.01)