改良亞胺培南-EDTA紙片增效試驗檢測銅綠假單胞菌產金屬酶表型

嚴育忠，范惠清，鄭文龍，楊煥章，陸燕春，石 毅

(上海市浦東醫院檢驗科，上海 201300)

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)是一種醫院感染的重要條件致病菌。近年來產金屬酶PA在我國呈廣泛播散的趨勢，廣泛耐藥PA感染率逐年增多[1]，產金屬酶PA感染患者的死亡率也在逐年上升[2]。因此及時檢測產金屬酶PA對合理使用抗菌藥物及控制病原菌播散非常重要[3-5]。乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)是一種應用比較普遍的金屬酶抑制劑，但其是通過膜滲透作用來增加細菌對抗菌藥物的敏感性。因此目前普遍采用的紙片增效試驗出現了較高的假陽性率[6-7]。我們將這一方法進行改良，先提取待測菌株酶液，去除了菌膜的影響因素。在試管內預先將EDTA和酶液進行反應，以大腸埃希菌(ATCC 25922)為指示菌，觀察亞胺培南-EDTA紙片增效試驗檢測金屬酶表型的效率。

材料和方法

一、材料

1.試驗菌株和質控菌株 (1)試驗菌株:收集2010年1至12月上海市浦東醫院臨床分離的對碳青霉烯類藥物(亞胺培南和/或美羅培南)耐藥PA 95株，試驗前所有菌株經Vitek 2 Compact全自動鑒定系統重新鑒定;(2)質控菌株:大腸埃希菌(ATCC 25922)，PA(ATCC 27853)。

2.抗菌藥物及標準品 藥物敏感性紙片[亞胺培南(10 μg)紙片和美羅培南(10 μg)紙片]購于英國Oxoid公司，亞胺培南粉劑為杭州默沙東制藥有限公司商品，美羅培南標準品為衛生部中國生物制品藥品鑒定所標準品。

3.試劑及儀器 EDTA為Sigma公司商品，Vitek 2 Compact全自動鑒定系統(法國生物梅里埃公司)、TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice(日本TaKaRa公司)、電泳槽、凝膠成像系統(美國BIORAD公司)和加熱儀等。引物由上海生工生物工程有限公司合成，聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。

二、方法

1.藥物敏感性測定 采用瓊脂稀釋法測定所有菌株對亞胺培南、美羅培南和厄他培南的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentrations，MIC)值，濃度范圍為 0.125 ～128 μg/mL，試驗操作與結果判斷均按美國臨床實驗室標準化協會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)標準[8]進行。

2.EDTA紙片增效試驗檢測金屬酶 (1)常規方法:參考文獻[9]，以0.5麥氏單位待檢菌菌液均勻涂布在水解酪蛋白胨瓊脂平板，中間貼亞胺培南藥物紙片2張，其中一張亞胺培南藥物紙片上加0.1 mmol/L EDTA 溶液 10 μL，紙片間距＞4 cm，35℃過夜培養，結果以△=d(亞胺培南+EDTA)-d(亞胺培南)≥5 mm為陽性;(2)改良法:①酶液制備，將待檢菌株接種在水解酪蛋白胨肉湯中增菌，離心收集細菌，用0.01 mmol/L磷酸鹽緩沖液沖洗后制成一定濃度的細菌液，再用凍融法(-70℃快速冷凍和37℃水浴快速解凍，反復5次)破碎菌細胞，使其菌體內的酶釋放出來，再離心(22000×g，1 h)去除細菌碎片，收集上清液即為酶液粗提物;②反應液制備，上述酶液和EDTA以4∶1的比例制備，以0.5麥氏濁度單位的大腸埃希菌(ATCC 25922)菌液均勻涂布于水解酪蛋白胨平板，分別貼亞胺培南、亞胺培南+EDTA(10 μL)、亞胺培南 + 酶液(10 μL)和亞胺培南+反應液(10 μL)4張紙片，紙片間距＞4 cm，35℃過夜培養，亞胺培南和亞胺培南+EDTA 2張紙片為空白對照，結果判斷以△=d(亞胺培南+反應液)-d(亞胺培南+酶液)≥5 mm為陽性。

3.PCR擴增 煮沸法提取細菌DNA模板，擴增 IMP-1、IMP-2、VIM-1、VIM-2、SIM-1、SPM-1、GIM共7組金屬酶基因，所需的引物序列和PCR反應條件均按參考文獻[10-11]進行。PCR擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統觀察結果并照相。PCR擴增產物送上海生工生物工程有限公司進行雙脫氧鏈末端終止法測序，結果在GenBank上查詢。

三、統計學方法

藥物敏感性試驗結果用WHONET5.4軟件進行統計分析。以PCR檢測結果為金標準，以敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值評估2種紙片增效試驗檢測金屬酶的效果。

結 果

一、藥物敏感性試驗

95株PA對亞胺培南和美羅培南的MIC值分別為 8 ～ ＞128 μg/mL 和 0.125 ～ ＞128 μg/mL。亞胺培南的耐藥率為100.0%(95/95)，美羅培南的耐藥率、中介率和敏感率分別為71.6%(68/95)、2.1%(2/95)和 26.3%(25/95)。其中，有68株亞胺培南和美羅培南均表現為耐藥，25株亞胺培南耐藥而美羅培南敏感，2株為亞胺培南耐藥而美羅培南中介。見表1。

表1 95株受試菌對亞胺培南和美羅培南的藥物敏感性分析

二、PCR擴增金屬酶基因及DNA測序結果

PCR擴增檢出8株金屬酶基因陽性菌株，占95株碳青霉烯類抗菌藥物不敏感PA菌株的8.4%。DNA測序結果顯示，7株含IMP-9型基因，1株含VIM-2型基因。

三、常規及改良亞胺培南-EDTA紙片增效試驗結果比較

常規法8株產金屬酶菌株均顯示陽性結果，同時有3株不產金屬酶菌株顯示陽性結果;改良法與PCR結果均一致，見表2。改良后亞胺培南-EDTA紙片增效試驗結果見圖1。其中在圖1(b)中，金屬酶陰性PA菌株改良法呈陰性結果，值得指出的是在部分菌株的試驗中，含酶液的紙片抑菌圈比不含酶液的紙片抑菌圈小，原因有待進一步研究。

表2 95株受試菌PCR結果與常規法及改良法的比較

圖1 改良后的亞胺培南-EDTA紙片增效試驗結果

四、方法學分析

亞胺培南-EDTA紙片增效試驗常規法和改良法的敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值見表3。

表3 常規法與改良法的敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值分析 (%)

討 論

上世紀90年代發現產金屬酶PA，金屬酶基因常位于Ⅰ類整合子和質粒等遺傳物質上，可發生水平傳播[3，12-13]。由于碳青霉烯類藥物被認為是目前抗革蘭陰性桿菌的最后一道防線，細菌產金屬酶往往會對此類藥物產生耐藥，因此對于金屬酶的檢測有利于感染的治療和控制[14]。

PA對碳青霉烯類藥物耐藥除因產金屬酶外，其他因素如0prD2膜蛋白缺失或減少、泵出機制MexAB-0prM的高表達也可使PA對不同碳青霉烯類藥物表現出不同的耐藥性。本研究中95株耐碳青霉烯類藥物PA對亞胺培南的耐藥率明顯高于美羅培南，與文獻報道[15]一致，主要原因可能是0prD2蛋白的缺失或減少所致。他們對亞胺培南和美羅培南的耐藥結果以二者均耐藥和前者耐藥后者敏感2種模式為主，而8株產酶菌株為均耐藥模式。25株表現為亞胺培南耐藥而美羅培南敏感模式的菌株經金屬酶基因PCR擴增后結果均顯示陰性。

目前國內耐碳青霉烯類藥物PA產金屬酶比例在10%左右[16]。本研究對95株耐碳青霉烯類藥物PA進行PCR檢測金屬酶基因，結果陽性率為8.4%。金屬酶具有碳青霉烯酶及依賴金屬的特性，改良Hodge試驗僅針對碳青霉烯酶水解活性，CLSI文件不推薦對PA進行金屬酶的檢測。由于E-test成本昂貴，PCR技術要求較高，使得E-test和PCR均不適合作為常規試驗。EDTA因獲取容易、價格低廉是實驗室常用的金屬酶抑制劑，EDTA的紙片增效試驗具有操作簡單、結果易讀的特點。然而常規的紙片增效試驗中，EDTA一方面因抑制待測菌株的生長可能導致假陽性結果，而且 EDTA 濃度越高假陽性率越高[9，17-18];另一方面因增強了細菌膜通透性，細菌對抗菌藥物敏感性的增加也可能導致假陽性結果[6-7]。因此我們對常規的試驗方法進行了改良，通過提取受試菌酶液，預先將酶液和EDTA在試管內進行反應，同時反應液中EDTA的相對用量也比常規法少，使得EDTA對試驗的影響明顯下降。在常規試驗中，3株假陽性菌株采用改良試驗均顯示陰性結果。我們推測在目前PA對碳青霉烯類藥物耐藥性主要受膜蛋白影響的情況下，常規試驗的假陽性率可能會比較高，有文獻報道耐碳青霉烯類藥物PA菌株常規試驗陽性，對金屬酶基因PCR擴增結果均為陰性[19]。本研究結果顯示，經過改良后的亞胺培南-EDTA紙片增效試驗對耐碳青霉烯類藥物的PA金屬酶的檢測敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值均為100.0%，取得了非常好的效果。

綜上所述，改良后的亞胺培南-EDTA紙片增效試驗較常規法檢測效果更好，但本研究菌種及標本數量有限，金屬酶也僅包括了亞胺培南和美羅培南2種，尚需擴大標本量進一步研究。

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