安圖醫院尿路感染患者中段尿中分離出的糞腸球菌和屎腸球菌的耐藥性分析

鮑彩麗，范倩燕，吳 迪，湯園園，談秋雯，張雪蓮

(1.復旦大學生命科學院，上海 200093;2.安圖醫院檢驗科，上海 200093)

腸球菌屬細菌作為一種條件致病菌已成為醫院感染，尤其是尿路感染的重要病原體之一。臨床上常見的腸球菌屬細菌為糞腸球菌和屎腸球菌。氨基糖苷類與作用于細菌細胞壁抗菌藥物的聯合應用是治療腸球菌感染的主要手段。一旦腸球菌對氨基糖苷類高水平耐藥，則協同作用消失[1]。為了解糞腸球菌和屎腸球菌耐藥性特征的變化情況，以指導臨床合理使用抗菌藥物，及時控制醫院感染，我們對從尿路感染患者中段尿中分離出的23株糞腸球菌和18株屎腸球菌進行細菌耐藥性檢測，并分析其相關的耐藥基因。

材料和方法

一、菌株來源及鑒定

收集2012年1至10月安圖醫院檢驗科從尿路感染患者中段尿標本中分離出的41株腸球菌，其中糞腸球菌23株(56.1%)、屎腸球菌18株(43.9%)。同一患者連續分離出相同菌株，取首次分離菌株。菌種鑒定采用API板條(法國生物梅里埃公司)進行鑒定。

二、藥物敏感性試驗

采用紙片擴散法，試驗方法與判斷標準依據美國臨床實驗室標準化協會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)2012 年版規定[2]。藥物敏感性紙片、羊血瓊脂平板、水解酪蛋白胨瓊脂均為科瑪嘉公司產品。

三、腸球菌屬相關耐藥基因檢測

1.引物設計與合成 7種耐藥基因包括氨基糖苷類藥物耐藥基因 aac(6')/aph(2')、ant(6)-Ⅰ、aph(3')-Ⅲ，紅霉素耐藥相關基因ermB，四環素類藥物耐藥基因tetM，萬古霉素耐藥基因vanA、vanB。在GenBank中查詢腸球菌屬的耐藥基因的基因序列，運用Primer Primer 5.0序列分析軟件設計引物，選擇最佳的引物進行后續研究。由Invitrogen公司合成。基因序列見表1。

表1 腸球菌耐藥基因引物序列

2.腸球菌屬DNA的提取 取純培養菌落懸于細菌培養液1～5 mL，11500×g離心1 min后取沉淀，使用北京天根生化科技有限公司的TIANGEN細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)提取腸球菌屬DNA，－20℃備用。

3.聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增 按照北京天根生化科技有限公司的PCR反應試劑盒2×Taq MasterMix說明書配制反應體系，各種耐藥基因擴增的循環參數為:95℃預變性5 min;94 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，循環35次;72℃延伸7 min。

4.擴增產物分析 擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，經DNA Green染色后在紫外光下觀察電泳結果，采用凝膠圖像分析系統攝像保存。

5.陽性基因測序 測序由Invitrogen公司完成。測序結果采用美國國立生物技術信息中心的Blast軟件分析。

四、統計學方法

采用 SPSS 13.0軟件進行 χ2檢驗，P ＜0.05為差異具有統計學意義。

結 果

一、腸球菌屬的藥物敏感性試驗

屎腸球菌對青霉素、氨芐西林、環丙沙星、左氧氟沙星、紅霉素的耐藥率為100.0%，糞腸球菌對青霉素、四環素、環丙沙星、左氧氟沙星、紅霉素的耐藥率＞50.0%，糞腸球菌和屎腸球菌的耐高濃度慶大霉素的檢出率分別為56.5%和55.6%。屎腸球菌對青霉素、氨芐西林的耐藥性較糞腸球菌高(P＜0.01);屎腸球菌對紅霉素、環丙沙星和左氧氟沙星等抗菌藥物的耐藥性與糞腸球菌比較差異無統計學意義(P＞0.05)。未檢出耐萬古霉素的腸球菌。41株腸球菌對11種抗菌藥物的耐藥率見表2。

表2 腸球菌對11種抗菌藥物的耐藥率

二、耐藥基因檢測

1.腸球菌屬耐藥基因檢測 41株多耐藥腸球菌中，陽性基因 aac(6')/aph(2')、aph(3')-Ⅲ均檢出41株，檢出率均為100.0%;ant(6)-Ⅰ基因檢出40株，檢出率為97.6%;ermB基因檢出29株，檢出率為70.7%;tetM基因檢出15株，檢出率分別為36.6%;vanA和vanB基因檢出0株，檢出率均為0.0%。部分耐藥腸球菌的PCR產物電泳凝膠成像圖見圖1。大多數菌株存在≥2種耐藥基因。分離出的23株糞腸球菌中，tetM、ermB、aac(6')/aph(2')、ant(6)-Ⅰ、aph(3')-Ⅲ基因陽性檢出率分別為 65.2%、82.6%、100.0%、100.0%和100.0%;分離出的18株屎腸球菌中，tetM、ermB、aac(6')/aph(2')、ant(6)-Ⅰ 和aph(3')-Ⅲ基因陽性檢出率分別為 55.5%、55.5%、100.0%、94.4%和 100.0%。

圖1 部分耐藥腸球菌的PCR產物電泳凝膠成像圖

2.腸球菌屬耐藥表型與基因型比較 41株進行基因檢測的多藥耐藥腸球菌中，對氨基糖苷類藥物的耐藥表型與基因型符合株有24株，符合率為58.5%;紅霉素類耐藥表型與ermB基因型符合株有30株，符合率為78.9%;四環素類耐藥表型與tetM基因型符合株有34株，符合率為61.8%。

3.陽性基因的測序 本研究的陽性基因的測序結果經過NCBI的Blast軟件分析，并與NCBI已登錄的相應基因序列相比較，結果一致。

討 論

近年來腸球菌屬作為條件致病菌所致的感染率持續升高，尤其對于那些有嚴重基礎疾病、機體免疫力低下的患者，容易侵入體內或易位，導致局部或全身感染。腸球菌由于其細胞壁厚，對多種抗菌藥物呈現固有耐藥。美國醫院感染監視系統已將其列為醫院感染的第二大病原菌[3]。本研究分析了安圖醫院尿路感染患者中段尿中分離出的腸球菌屬細菌的耐藥率及其相關的耐藥基因。結果顯示分離出的腸球菌屬以糞腸球菌多見，占56.1%;屎腸球菌占43.9%。體外藥物敏感性試驗結果顯示，屎腸球菌對青霉素和氨芐西林的耐藥率均為100.0%，糞腸球菌對青霉素和氨芐西林的耐藥率分別為52.2%和21.7%，未檢出耐萬古霉素的腸球菌屬，與其他報道[4]有一定的差異，可能是由于菌株來源地區不同所致。另外，本研究藥物敏感性試驗結果顯示，糞腸球菌和屎腸球菌的耐藥情況嚴重，其中屎腸球菌的耐藥性比糞腸球菌要嚴重得多，與文獻報道[5-6]一致。屎腸球菌對青霉素、氨芐西林、環丙沙星、左氧氟沙星和紅霉素的耐藥率明顯高于糞腸球菌，提示臨床對于屎腸球菌感染的經驗治療應避免使用上述藥物。未發現對萬古霉素耐藥的菌株，提示萬古霉素等糖肽類抗菌藥物仍是臨床治療腸球菌感染的最有效藥物。但是隨著萬古霉素的大量應用，耐萬古霉素腸球菌的感染逐漸增多，這就要求我們一方面要不斷完善實驗室對耐萬古霉素腸球菌的檢測，另一方面還應加強臨床對抗菌藥物使用的管理，尤其嚴格萬古霉素等糖肽類抗菌藥物使用的適應征，防止和減緩耐萬古霉素腸球菌的產生[7]。

腸球菌對氨基糖苷類藥物的耐藥機制主要是產生質粒介導的氨基糖苷類修飾酶，以aac(6')/aph(2')、ant(6)-Ⅰ和 aph(3')-Ⅲ等基因型為常見。本研究41株臨床分離株中aac(6')/aph(2')和aph(3')-Ⅲ基因在糞腸球菌和屎腸球菌陽性率均達到100.0%，ant(6)-Ⅰ基因陽性率為97.6%。研究糞腸球菌與屎腸球菌表型與基因型的關系發現，氨基糖苷類藥物的耐藥表型與基因型符合率為58.5%，屎腸球菌與糞腸球菌存在表型為敏感而檢出耐藥基因的情況，可能與基因未表達或表達不完全有關。研究表明氨基糖苷類修飾酶基因在臨床分離腸球菌中的存在狀況十分廣泛，耐藥情況嚴重。

紅霉素耐藥相關基因ermB的檢出率達70.7%，erm(ermA、ermB)基因表達紅霉素核糖體甲基化酶，使細菌核糖體紅霉素作用靶位點發生甲基化，從而耐紅霉素。細菌一旦獲得erm基因，將對大環內酯類－林可酰胺類－鏈陽菌素B耐藥[8]。紅霉素類耐藥表型與ermB基因型符合率為78.9%。

四環素類藥物耐藥機制有2類，一類為產核糖體保護蛋白;另一類為產TET外排泵蛋白。腸球菌屬可以通過獲得tetM基因表達核糖體保護蛋白使其免受四環素類抗菌藥物的作用[9]。本研究中四環素類藥物耐藥基因tetM陽性率為36.6%。四環素類耐藥表型與tetM基因型符合率為61.8%。

臨床分離的糞腸球菌和屎腸球菌在泌尿系統的感染最為常見，屎腸球菌對臨床常用抗菌藥物的耐藥率高于糞腸球菌，且多藥耐藥和高耐現象相當嚴重。腸球菌對氨基糖苷類藥物的耐藥機制主要由 aac(6')/aph(2')、ant(6)-Ⅰ、aph(3')-Ⅲ基因介導，產生ermB基因則是腸球菌對大環內酯類藥物耐藥的主要原因，腸球菌攜帶tetM基因并表達是對四環素耐藥的主要原因。在治療時，應根據耐藥特點及菌種間的耐藥性差異來選擇相應的治療方案。目前萬古霉素和利奈唑胺仍然是治療腸球菌感染的最好藥物。加強細菌耐藥基因檢測，對于科學制定抗菌感染治療方案以提高救治成功率，并為細菌耐藥性監測及流行病學調查提供分子生物學依據具有實際意義。

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