HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭患者血清細胞因子水平與疾病預(yù)后的關(guān)系研究

羅光成，黃云麗，閆惠平，馮 霞，林 芳，凡瞿明，張國元

(1.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，四川 南充 637000;2.首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院感染與免疫研究中心，北京 100069)

慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure，ACLF)是在慢性肝病的基礎(chǔ)上，短期內(nèi)出現(xiàn)以黃疸和凝血功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的急性肝臟損傷。我國乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染率較高，HBV感染是肝衰竭的首要原因。在肝衰竭發(fā)生過程中肝組織依次經(jīng)受了免疫損傷、缺血缺氧性損傷和內(nèi)毒素血癥的三重打擊，其中免疫損傷在肝衰竭發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用。細胞因子在免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)中起著重要的作用，與肝衰竭過程中的肝細胞壞死和疾病臨床預(yù)后密切相關(guān)，如腫壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、白細胞介素(interleukin，IL)-6和 γ 干擾素(interferon-gamma，IFN-γ)等[1-5]。盡管越來越多的證據(jù)表明，細胞因子在ACLF的發(fā)生、發(fā)展中起了重要的作用，但其與疾病預(yù)后的關(guān)系仍未完全闡明。我們采用Luminex技術(shù)檢測HBV相關(guān)ACLF患者血清多項細胞因子，以觀察ACLF患者血清細胞因子的變化情況，并探討細胞因子在臨床轉(zhuǎn)歸中的作用。

材料和方法

一、研究對象

收集2011年1月至2012年2月期間北京佑安醫(yī)院收治的HBV相關(guān)ACLF患者24例(治愈者13例，即癥狀體征明顯好轉(zhuǎn)或消失，肝功能轉(zhuǎn)至正常的患者;死亡者11例，包括宣布臨床死亡和經(jīng)專家評估無治愈可能而放棄治療的患者)，ACLF診斷符合2006年《肝衰竭診療指南》;收集同期住院的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者30例，CHB診斷符合2010版《慢性乙型肝炎防治指南》。同時設(shè)健康對照15名。全部病例均排除其他嗜肝病毒重疊感染、人類免疫缺陷病毒感染和嚴重細菌、真菌感染，排除自身免疫性、酒精性、藥物性、脂肪性等其他因素引起的肝損傷，既往或近期未使用免疫抑制劑治療。本研究得到了北京佑安醫(yī)院倫理委員會的支持，所有研究對象均簽署了知情同意書。終末期肝病模型(model for end-stage liver disease，MELD)公式:r=3.8 lnTBil(mg/dL)+11.2ln(INR)+9.6lnCRE(mg/dL)+6.4(病因:膽汁性或酒精性0，其他1)[6]，公式中l(wèi)n為自然對數(shù)natural logarithm 的縮寫。3組對象的基本信息見表1。3組間年齡性別基本一致，ACLF組丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)明顯高于 CHB組和對照組(P ＜0.01)。

表1 各組研究對象的一般情況

二、Luminex檢測多項細胞因子

采集患者入院時的外周血樣本并及時分離血清，檢測其 IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、粒細胞-巨噬細胞刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、IFN-γ 和 TNF-α 濃度。取出Bio-Plex多細胞因子檢測試劑盒(美國BIO-RAD公司)平衡至室溫，按試劑說明書稀釋樣本、標準品、抗體包被微球、生物素標記的檢測抗體和藻紅蛋白(phycoerythin，PE)標記的鏈霉親和素。首先，加入已稀釋的微球50 μL于96孔板，洗滌2次并吸去微孔內(nèi)緩沖液;加入50 μL已稀釋的標準品、陰陽性對照和已稀釋樣本，室溫震蕩溫育30 min;洗滌3次，再加入已稀釋的檢測抗體25 μL，室溫震蕩溫育30 min;洗滌3次，再加入50 μL已稀釋的PE標記的鏈霉親和素，室溫震蕩溫育10 min;洗滌3次，再加入125 μL分析緩沖液重懸微球。震蕩混勻30 s后上機檢測。檢測儀器為Bio-Plex 200LUMINEX儀(美國BIORAD公司)。

三、血常規(guī)、血生化、乙型肝炎標志物和HBV DNA載量檢測

血常規(guī)檢測采用日本Sysmex KX-21全自動血液分析儀及配套試劑。血生化檢測采用富士700全自動生化分析儀及配套試劑。乙型肝炎標志物5項檢測采用德國羅氏Cobas e601全自動電化學發(fā)光儀及配套試劑。HBV DNA檢測采用美國ABI-7300熒光聚合酶鏈反應(yīng)儀，HBV核酸定量檢測試劑盒由湖南圣湘生物科技公司提供。

四、統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件處理。正態(tài)分布的計量資料以表示，組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析和t檢驗。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù)(范圍)表示，采用非參數(shù)秩和檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、各組對象細胞因子水平的比較

ACLF組、CHB組和對照組3組間IL-6、IL-8和TNF-α水平差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，ACLF組＞CHB組 ＞對照組;HBV DNA、乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)等病毒學指標在各組間差異無統(tǒng)計學意義。見表2。

二、細胞因子和MELD評分在不同臨床轉(zhuǎn)歸ACLF患者中的比較

死亡組IL-6、TNF-α水平和MELD評分明顯高于治愈組(P＜0.05)。見表3。

表2 ACLF組、CHB組和對照組細胞因子及HBV DNA、HBsAg水平的比較

表3 不同臨床轉(zhuǎn)歸ACLF患者細胞因子和MELD評分的比較

三、細胞因子與臨床指標的相關(guān)性分析

由于 ACLF 組 IL-6、IL-8、TNF-α 明顯升高，且死亡組IL-6、TNF-α明顯高于治愈組，進一步分析ACLF 患者 IL-6、IL-8、TNF-α 與 ALT、AST、凝血酶原活動度(prothrobin activity，PTA)、MELD評分等臨床指標的相關(guān)性。結(jié)果顯示IL-6、TNF-α與PTA 呈明顯負相關(guān) (r= －0.521，P=0.009;r=－0.712，P ＜ 0.001);TNF-α、IL-6 與 MELD 評分之間呈明顯正相關(guān)(r=0.491，P=0.015;r=0.379，P=0.048)。而其他細胞因子與 ALT、AST、HBV DNA、HBsAg等指標之間無明顯相關(guān)性。見圖1。

圖1 IL-6、TNF-α與PTA、MELD評分之間相關(guān)性分析

討 論

在我國，HBV相關(guān)的ACLF是肝衰竭的主要類型，其發(fā)生機制十分復(fù)雜，目前尚未完全明確。有研究表明，系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)是 ACLF的重要病理生理過程之一，而細胞因子在SIRS的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用[2]。ACLF的二次損傷學說也同樣強調(diào)細胞因子的重要性。二次損傷學說認為:HBV感染后，機體產(chǎn)生特異性細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)，特異性CTL為清除HBV而攻擊感染HBV的肝細胞，從而造成大量的肝細胞溶解和凋亡，這稱為原發(fā)性損傷。原發(fā)性肝損傷能引起腸源性內(nèi)毒素血癥，并激活Kuffer細胞釋放多種細胞因子，進而啟動一系列級聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生大量的細胞因子，這些細胞因子在介導(dǎo)肝臟損傷的同時還進一步募集大量非特異性炎性細胞于肝臟，從而對肝臟造成更為嚴重的二次損傷，甚至導(dǎo)致肝衰竭[6-7]。

細胞因子是細胞間信號傳遞分子，根據(jù)其功能可以分為促炎細胞因子 (如IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-γ)和抗炎細胞因子(如 IL-4、IL-10)[8-9]。本研究通過對ACLF組、CHB組和對照組細胞因子水平的比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn) IL-6、IL-8和 TNF-α水平從對照組到ACLF組呈逐漸升高趨勢(ACLF組＞CHB組＞對照組)，3組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);IL-4、IL-10等其他細胞因子在ACLF患者無明顯升高。Mao等[10]和 Zou 等[11]的研究結(jié)果表明，ACLF患者肝內(nèi)IFN-γ和TNF-α表達較CHB患者明顯升高，而抗炎性細胞因子IL-10卻沒有相應(yīng)的升高，這種促炎和抗炎細胞因子表達失衡可能是ACLF發(fā)生的免疫病理機制。然而本研究結(jié)果中盡管升高細胞因子的種類不盡相同，但也同樣發(fā)現(xiàn)了促炎和抗炎細胞因子表達失衡。這提示IL-6、IL-8和TNF-α等促炎性細胞因子升高與ACLF的發(fā)生密切相關(guān)，可能在肝臟損傷等病理過程中起重要作用。

由于 IL-6、IL-8、TNF-α 等細胞因子可能在ACLF病理生理過程中起重要作用，故本研究進一步比較了死亡組和治愈組之間的IL-6、IL-8和TNF-α水平。結(jié)果顯示，死亡組IL-6和TNF-α水平顯著高于治愈組(P＜0.05)。這提示IL-6和TNF-α嚴重升高時預(yù)示著疾病預(yù)后不良。在本研究中的ACLF患者均伴有一種或多種并發(fā)癥，并且死亡組的并發(fā)癥數(shù)量更多、更嚴重。這表明促炎細胞因子IL-6和TNF-α與ACLF的并發(fā)癥之間可能互為因果、相互促進。有研究表明，血液循環(huán)中高濃度的細胞因子也會產(chǎn)生激素樣的內(nèi)分泌效應(yīng)，其作用于遠離分泌部位的其他組織器官，從而導(dǎo)致血壓升高、肺損傷和腦水腫等并發(fā)癥的產(chǎn)生[10]，這可能在一定程度上解釋了高濃度細胞因子、并發(fā)癥和疾病預(yù)后不良三者間的關(guān)系。

IL-6和 TNF-α均是強效的促炎細胞因子。有研究表明，血清IL-6水平與肝細胞壞死程度相關(guān)，并且可在一定程度上反映急性肝衰竭的嚴重程度[4，12];TNF-α 是造成肝細胞損傷的主要因子，高水平的TNF-α可以誘導(dǎo)肝細胞凋亡與壞死[6]。本研究對ACLF患者血清IL-6、IL-8、TNF-α水平與ALT、AST、PTA和MELD評分的相關(guān)性進行分析，結(jié)果顯示TNF-α、IL-6與PTA呈明顯負相關(guān)，TNF-α、IL-6與MELD評分呈明顯正相關(guān)。MELD評分是用于判斷終末期肝病嚴重程度和生存率的預(yù)測指標，PTA也是反應(yīng)肝臟合成功能和疾病嚴重程度的指標。這說明IL-6和TNF-α與疾病嚴重程度和臨床轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)，可能是判斷疾病嚴重程度和臨床預(yù)后的新指標。

綜上所述，HBV相關(guān)ACLF患者血清中多種細胞因子明顯升高，其中促炎細胞因子IL-6和TNF-α隨疾病嚴重程度的增加而增加(ACLF死亡組＞ACLF治愈組＞CHB組＞對照組)，且與PTA、MELD評分之間有良好的相關(guān)性。這提示細胞因子可能在ACLF發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用，并且促炎性細胞因子(如IL-6、TNF-α)與SIRS之間可能互為因果，共同促進ACLF的發(fā)生。因此，檢測血清細胞因子變化對ACLF患者疾病嚴重程度和臨床轉(zhuǎn)歸的判斷有重要意義。然而，本研究僅分析了血清細胞因子的表達變化，由于血清細胞因子來源復(fù)雜，故只能在一定程度上反映肝臟的細胞因子變化特點。另外，因研究對象特殊而使ACLF組樣本量較小，故尚需擴大樣本量進行觀察和研究。

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