保肝藥物體內活性篩選方法的建立

云南中醫學院，云南 昆明 650500

保肝藥物體內活性篩選方法的建立

吳愛萍段小花周志宏代蓉淤澤溥*

云南中醫學院，云南 昆明 650500

目的建立一種穩定便捷的保肝藥物活性篩選方法。方法用CCl4復制小鼠急性肝損傷模型，考察CCl4染毒劑量、染毒時間及染毒途徑對實驗結果的影響，選擇陽性對照藥物，多次重復實驗來考察方法的穩定性。結果對小鼠一次性腹腔注射0.2% CCl4橄欖油溶液0.1ml/10g.bw，染毒20h后，模型組小鼠血清ALT、AST均高于正常組 (P<0.01)，可成功復制急性CCl4肝損傷模型；聯苯雙酯組小鼠血清ALT低于模型組(P<0.01)，提示其有保肝降酶作用，故選擇聯苯雙酯作為陽性對照藥；經多次方法學考察，確定已建立了穩定的保肝藥物活性篩選實驗方法。結論對小鼠一次性腹腔注射0.2%CCl4橄欖油溶液0.1ml/10g.bw，染毒20h，可以成功復制結果穩定的小鼠CCl4急性肝損傷模型。

急性CCl4肝損傷模型；保肝作用；活性篩選方法

肝臟被譽為人體的化工廠，在機體代謝中有極其重要的作用。肝臟疾病是人類最常見的疾病之一, 嚴重威脅著人類健康。許多因素，如病毒、生物、藥物、理化、酒精及全身性疾病的影響，都可以導致肝損傷。研究證明，無論何種原因引起的肝臟病變，肝細胞損傷都是其共同的病理基礎[1-3]。肝損傷長期存在，往往是導致肝纖維化，甚至肝硬化、肝癌發生的重要始動因素。研究開發具有保肝活性的藥物是防治各類肝臟疾病的重要措施之一，為尋找和發現更好的保肝藥物，需建立適用于保肝藥物活性篩選的研究方法。我們通過多次重復實驗，建立了穩定的小鼠四氯化碳急性肝損傷動物模型，成功地應用于保肝藥物和活性成分的追蹤篩選研究。

1 材料

昆明種小鼠，清潔級，雌雄兼用，體重18～22g。均購自四川省醫學科學院實驗動物研究所，合格證號：SCXK(川)2008-24。批號：Dossy2010-12。四氯化碳(CCl4)：分析純，≥99.5%，武漢聯堿廠，批號：20040310；益肝靈片： 國藥準字Z19994019，每片含水飛薊賓77mg，四川志遠廣和制藥有限公司，批號：100901；聯苯雙酯滴丸：國藥準字H33020232，1.5mg×250丸/瓶，5粒/次，每日3次；浙江醫藥股份有限公司新昌制藥廠，批號：100409、101004。

2 方法

2.1 染毒物質的確定 保肝藥物活性篩選的目的是通過規范化的實驗研究方法，確定受試物是否具有保肝降酶作用及其保肝活性成分所在部位，為進一步研究和開發保肝新藥提供實驗依據。

為了明確受試物中保肝活性成分的存在部位，需建立一種穩定、可靠、重現性好的篩選方法，復制適當的肝損傷動物模型，選擇簡單易行的檢測指標。經查閱文獻[1-3]，擬建立小鼠CCl4急性化學性肝損傷模型，用于保肝藥物活性追蹤篩選。

2.2 CCl4染毒劑量、染毒時間及染毒途徑的考察 通過查閱文獻[4-7]，小鼠CCl4急性肝損傷模型造模的主要影響因素是染毒劑量、染毒時

間，因此首先考察這兩個主要因素。染毒劑量決定于毒物的濃度和給藥體積，為了使各組的給藥體積一致，本實驗采用同體積不同濃度的方法，即染毒劑量由濃度決定。故參考文獻[9-12]將CCl4設置了0.05%、0.1%、0.2%三個濃度，給藥體積均按0.1ml/10g。染毒時間是指藥物進入機體后發揮毒性作用的時間，也是影響毒性的主要因素，故參考文獻[9-12]選擇12h、16h和20h三個時間點。染毒途徑也是必須考慮的，CCl4染毒常用腹腔注射和皮下注射兩種染毒途徑，但皮下注射常有少量藥液從注射部位漏出，影響染毒劑量的準確性，故本實驗采用腹腔注射。

[4-7]方法，取昆明種清潔級小鼠100只，雌雄各半，體重18～22g。按體重與性別隨機分為10組，即正常對照組和CCl4三個染毒劑量不同染毒時間的9個組(見表1分組)。每組動物均為10只。除正常對照組外，其余各組分別腹腔注射0.05%、0.1%、0.2%三個不同濃度的CCl4橄欖油溶液0.1ml/10g.bw。造模后(禁食不禁水)12h、16h和20h分別摘眼球取血，以5000r/min離心15min，分離血清，按測定試劑盒(賴氏法)操作方法分別測定血清血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉移酶(AST)。

2.3 陽性藥物的選擇 我們首先考慮選擇的陽性藥物，其主要成分最好為從中藥或天然藥物得到的活性成分，以利于跟受試樣品作比較。通過查閱文獻[8]，益肝靈主要成分是水飛薊賓，而水飛薊賓為天然藥物水飛薊提取分離得到的活性成分。故選擇益肝靈作為陽性藥物進行預試驗。

2.3.1 以益肝靈作為陽性藥物 參考文獻[9]，取昆明種清潔級小鼠36只，雌雄各半，體重18～22g。按體重與性別隨機分為3組，即正常對照組、肝損傷模型組、益肝靈組，每組動物12只。益肝靈組灌胃給予相應藥物，其余兩組給予等體積1% CMC-Na，灌胃給藥體積均為0.1ml/10g.bw，1次/d，連續用藥6d，第6日給藥后30min，除正常對照組外，其余各組均腹腔注射0.1%的CCl4橄欖油溶液0.1ml/10g.bw，造模后禁食不禁水16h。同時第7日再給藥一次，末次給藥后30min，摘眼球取血，同前方法離心及分離血清，測定血清ALT、AST。

2.3.2 以聯苯雙酯作為陽性藥物 參考文獻[10]方法，取昆明種清潔級小鼠45只，雄性，體重18～22g。按體重與性別隨機分為3組，即正常對照組、肝損傷模型組、聯苯雙酯組，每組動物15只。聯苯雙酯組灌胃給予相應藥物，其余兩組給予等體積1% CMC-Na，灌胃給藥體積均為0.1ml/10g.bw，1次/d，連續用藥6d，第6日給藥后30min，除正常對照組外，其余各組均腹腔注射0.2%的CCl4橄欖油溶液0.1ml/10g.bw，造模后禁食不禁水20h。同時第7日再給藥一次，末次給藥后30min，摘眼球取血，同前方法離心及分離血清，測定血清ALT。

3 結果

3.1 CCl4不同染毒劑量及不同染毒時間對小鼠血清ALT、AST的影響 0.05%染毒劑量的三個不同時間組小鼠血清ALT、AST與正常對照組比較，差異無統計學意義，表明對小鼠腹腔注射一次0.05%CCl4尚不能引起小鼠急性肝損傷；0.1%染毒劑量的三個不同時間組小鼠血清ALT均高于正常對照組，差異有非常顯著性意義(P<0.01)，但AST要16h后才升高；0.2%染毒劑量的三個不同時間組小鼠血清ALT、AST在三個時間點均高于正常對照組，差異有非常顯著性意義(P<0.01)。見表1。

表1 CCl4不同染毒劑量及不同染毒時間對小鼠血清ALT、AST的影響

注：與正常組相比：△P<0.05，△△P<0.01

3.2 益肝靈對小鼠CCl4急性肝損傷模型ALT、AST的影響 模型組小鼠血清ALT、AST高于正常對照組，差異有非常顯著性意義(P<0.01)，表明造模成功；益肝靈組小鼠血清ALT、AST與模型組比較，無統計學意義；提示益肝靈在所用劑量未顯示出保肝降酶作用。見表2。

表2 益肝靈對小鼠CCl4急性肝損傷模型ALT、AST的影響

注：與正常組相比：△△P<0.01

由于上述實驗所選擇藥物未顯示出藥效，通過查閱文獻，我們發現文獻中多選擇聯苯雙酯作為陽性藥物，因此以聯苯雙酯為陽性藥物進行預試驗，為正式實驗選擇合適的陽性藥物及確定其劑量。

3.3 聯苯雙酯對小鼠CCl4急性肝損傷模型ALT的影響 模型組小鼠血清ALT高于正常對照組，差異有非常顯著性意義(P<0.01)，表明造模成功；聯苯雙酯組小鼠血清ALT低于模型組，差異有非常顯著性意義(P<0.01)。見表3。

表3 聯苯雙酯對小鼠CCl4急性肝損傷模型ALT的影響±s)

與正常對照組相比：△△P<0.01；與模型組相比：**P<0.01

4 討論

對小鼠進行腹腔注射一次CCl4橄欖油，血清ALT、AST隨著CCl4染毒劑量的增加而升高：①對小鼠進行0.05%CCl4不同染毒時間處理，小鼠血清ALT、AST未見明顯變化，表明小鼠腹腔注射一次0.05%CCl4，劑量偏小，尚不能成功復制急性肝損傷模型。②對小鼠進行0.1%CCl4不同染毒時間處理，除染毒12h小鼠血清AST未見明顯變化外，染毒12h小鼠血清ALT及染毒16h、20h小鼠血清ALT、AST均明顯升高；表明0.1%CCl4可以復制輕度急性肝損傷模型，但染毒時間延長至20h，ALT未見明顯升高，反而降低。③對小鼠進行0.2%CCl4染毒12h、16h及20h，小鼠血清ALT、AST均明顯升高，均可成功復制急性肝損傷模型，且造成的肝損傷程度較為適中、穩定。故我們認為：染毒劑量和染毒時間這兩個因素中，劑量因素更為重要。對小鼠一次性腹腔注射0.2%CCl4橄欖油溶液0.1ml/10g.bw，染毒20 h復制的模型，肝損傷程度較為合適，易于反映出藥物的保肝降酶作用，將在后續的保肝藥物活性追蹤篩選實驗中采用。

對于陽性藥物的選擇，在益肝靈和聯苯雙酯這兩個藥物中，聯苯雙酯顯示出良好的保肝降酶作用，因此選擇聯苯雙酯作為保肝實驗的陽性對照藥。

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2010年度國家自然科學基金項目獐牙菜苦苷在水中的熱轉化產物與青葉膽抗肝炎功能的相關性研究 項目編號：81060338。

吳愛萍(1981～)，女，云南人，云南中醫學院碩士研究生，研究方向：中藥藥理與應用。

淤澤溥，藥理學教授，E-mail：yuzepu@126.com

R285.5

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1007-8517(2014)08-0031-02

2014.02.10)