HPLC法測(cè)定紅花地上部分羥基紅花黃色素A和木犀草素的含量

內(nèi)蒙古民族大學(xué)，內(nèi)蒙古 通遼 028000

HPLC法測(cè)定紅花地上部分羥基紅花黃色素A和木犀草素的含量

王秀梅韓曉靜白梅榮關(guān)永仙

內(nèi)蒙古民族大學(xué)，內(nèi)蒙古 通遼 028000

目的建立紅花地上部分中羥基紅花黃色素A和木犀草素的含量測(cè)定方法。方法采用HPLC法，色譜柱為Eclipse plus-C18柱(5μm，4.6mm×150mm)，流動(dòng)相為甲醇-0.7%磷酸梯度洗脫，流速：1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)390nm，柱溫30℃。結(jié)果羥基紅花黃色素A在0.03μg/ml～0.19μg/ml，(r=0.999 9)；木犀草素在0.13μg/ml～0.80μg/ml，(r=0.999 5)范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，平均回收率為99.99%，98.95%(n=6)。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于羥基紅花黃色素A和木犀草素的含量測(cè)定。

紅花；高效液相色譜法；羥基紅花黃色素A；木犀草素；含量測(cè)定

紅花為菊科植物紅花CarthamustinctoriusL.的干燥花，對(duì)于花的主要成分，國(guó)內(nèi)外的許多學(xué)者進(jìn)行了比較深入的研究[1]，從紅花中分離得到的化學(xué)成分有醒式查爾酮普類，黃酮類，生物堿類，木脂素類，有機(jī)酸類，烷基二醇類化合物等。在紅花的研究進(jìn)展中研究紅花地上部分中的羥基紅花黃色素A和木犀草素還在初步的階段?，F(xiàn)代研究證明，紅花的地上部分中含有木犀草素和羥基紅花黃色素A[2]。以此推測(cè)，具有保肝作用，即木犀草素通過清除自由基，抑制自由基膠原蛋白基因表達(dá)，降低四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化。蒙醫(yī)學(xué)兩千年的臨床實(shí)踐證明，紅花保肝作用非常顯著。紅花在常用保肝作用的蒙藥復(fù)方中作為“君藥”主導(dǎo)著整個(gè)復(fù)方的作用方向。為了有效控制紅花地上部分的質(zhì)量，特采用HPLC法測(cè)定羥基紅花黃色素A和木犀草素的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent Technologies 1260lnfinty(美國(guó)安捷倫)；AUW220D電子分析天平(日本島津)；KQ-200VDE超聲儀(昆山)；RE52-AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海)。

1.2 試劑試藥

1.2.1 試藥 紅花地上部分來自內(nèi)蒙古通遼，經(jīng)內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院白梅榮教授鑒定為菊科植物紅花屬無刺紅花的莖葉。羥基紅花黃色素A對(duì)照品(批號(hào):GZGD-0552-201210)，對(duì)照品購自貴州迪大生物有限公司；木犀草素對(duì)照品(批號(hào):111520-200504)對(duì)照品購自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.2.2 試劑 甲醇色譜純，其它試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果[3-5]

2.1 色譜條件 Eclipse plus-C18柱(5μm，4.6mm×150mm)；流動(dòng)相：甲醇-0.7%磷酸按表1梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為390nm，柱溫：30℃，流速：1.0 ml /min。理論板數(shù)按木犀草素峰計(jì)算應(yīng)不低于2500。

表1 流動(dòng)相梯度表

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取羥基紅花黃色素A和木犀草素對(duì)照品適量，加甲醇制成含羥基紅花黃色素A 12.75μg/ml和木犀草素53.5μg/ml的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取紅花地上部分約1g，精密稱定，置50 ml量瓶中，加入甲醇溶液50ml，侵泡30min，超聲處理60min，放冷，濾過，濾液濃縮至約5ml，搖勻，作供試品溶液。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取陰性對(duì)照品、對(duì)照品和供試品溶液, 在上述色譜條件下分別進(jìn)樣15μl, 繪制HPLC 色圖譜。由圖可知供試品溶液和對(duì)照品溶液中羥基紅花黃色素A和木犀草素的保留時(shí)間是一致的，結(jié)果見圖。

照品HPLC色譜圖 供試品HPLC色譜圖

2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取上述對(duì)照品溶液2.5、5、7.5、10、12.5、15μl進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo), 峰面積值為縱坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為:Y羥基紅花黃色A=33.20336X-1.64057，r=0.9999，線性范圍0.03μg/ml～0.19μg/ml;Y木犀草素=12.74316X-1.03750，r=0.9995，線性范圍0.13μg/ml～0.80μg/ml。

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液15μL,連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得羥基紅花黃色素A和木犀草素峰面積RSD分別為0.26%，0.52%0(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品，按2.3項(xiàng)下方法，平行制成3份供試品溶液，進(jìn)樣15μL測(cè)定，羥基紅花黃色A和木犀草素峰面積的RSD分別為0.41%，0.56%(n=3)，表面本方法重現(xiàn)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液分別于0、2、4、6、8、10、24h進(jìn)樣，測(cè)得羥基紅花黃色素A和木犀草素峰面積RSD分別為0.70%，0.55%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的同批樣品6 份,分別精密加入一定量的羥基紅花黃色素A和木犀草素對(duì)照品,按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，按公式計(jì)算回收率，其RSD分別為99.99%，0.28%；98.95%，0.08%。

2.10 含量測(cè)定試驗(yàn) 精密吸取上述對(duì)照品溶液與供試品溶液各15μl,連續(xù)進(jìn)樣3次，按上述色譜條件測(cè)定并按外標(biāo)法計(jì)算含量，羥基紅花黃色A和木犀草素含量分別為7.16μg /g，0.22%；37.62μg /g，1.5%。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 以對(duì)照品溶液進(jìn)行各種波長(zhǎng)檢測(cè)，結(jié)果木犀草素在350nm有最大吸收波長(zhǎng)，羥基紅花黃色素A在403nm有最大吸收波長(zhǎng)。考慮到木犀草素在403nm的吸收波長(zhǎng)較弱，故選擇390nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相的選擇 試驗(yàn)過程中分別對(duì)不同比例的甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液，甲醇-0.7%磷酸溶液，不同梯度的甲醇-0.7%磷酸溶液進(jìn)行了考察，結(jié)果2.1項(xiàng)下所選定的梯度洗脫條件分離較好，且能通過峰純度驗(yàn)證，故選之。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典·第一部[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010.141.

[2] 韓煒，楊玉林，康延國(guó).HPLC法測(cè)定紅花地上部分木犀草苷和木犀草素的含量[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2010，28(6),199-201.

[3] 陳曦,龍曉蕾,王志宏.高效液相色譜法測(cè)定金銀花中木犀草素含量[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2009,35(2):127-129.

[4] 李偉光,李長(zhǎng)新.HPLC法測(cè)定筋骨草膠囊中木犀草素含量[J].中國(guó)醫(yī)藥指南,2009,7(13):39-40.

[5] 韓煒，邢燕，康延國(guó).紅花地上部分化學(xué)成分研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2010，28(4),211-213.

DeterminationtheContentofHydroxysaffloryellowAandLuteolininaerialpartofCarthamustinctoriusLbyHPLC

WANG Xiu-mei HAN Xiao-jing BAI Mmei-rong GUAN Yong-xian

College of Mongolian Medicine and pharmacy, Inner Mongolia University for Nationalities,Tongliao 028000,China

objective: To establish a HPLC method for determination the content of Hydroxysafflor yellow A and Luteolin in aerial part of Carthamus tinctorius L . Method: Determining the Hydroxysafflor yellow A and Luteolin in aerial part of Carthamus tinctorius L by HPLC on Eclipse plus-C18column(5μm，4.6mm×150mm) and with methanol-0.7% phosphoric acid gradient elution and the flow rate of 1.0ml·min-1. The detective wavelength was 390nm, and the temperature of the column was 30℃. Result: The obvious linear relationship were showed between the input mass of Hydroxysafflor yellow A and Luteolin as reference substance ranging from 0.03to 0.19μg and from 0.13 to 0.80μg; The average recovery of Hydroxysafflor yellow A is 99.99% and The average recovery of Luteolin is 98.95%(n=6).Conclusion: The method is simple, rapid, accurate and possesses good reproducibility. It can be used for determining the content of Hydroxysafflor yellow A and Luteolin in aerial part of Carthamus tinctorius L.

Carthamus tinctorius L.; HPLC; Hydroxysafflor yellow A; Luteolin; Determination

市?？萍己献黜?xiàng)目(SXYB2012030)

王秀梅，女，蒙古族，講師，從事蒙藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，Tel：18647531953，E-mail：wangxiumei1980@126.com

R284.1

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1007-8517(2014)08-0029-02

2014.02.10)