印記基因SLC22A18的表達與乳腺癌侵襲能力的關系

賀黌裕 張宏偉

(復旦大學附屬中山醫院 a重癥監護室，b普外科，上海 200032)

SLC22A18(solute carrier family 22, member 18)是位于人類染色體11p15.5的父源印記基因，與細胞的代謝和生長有關[1]。SLC22A18的表達異常與胚胎性腫瘤及多種實體腫瘤(如肺癌、肝癌等)相關。多項研究[2-4]發現，乳腺癌中SLC22A18表達異常，SLC22A18可能作為抑癌基因影響乳腺癌的侵襲轉移。本研究檢測了SLC22A18在2種乳腺癌細胞株MDA-MB-231(惡性程度高)和MCF-7(惡性程度低)中的表達水平，并采用Transwell法研究這2種乳腺癌細胞株侵襲轉移能力的差異。

1 資料與方法

1.1 主要試劑 兔抗人SLC22A18抗體購自美國Proteintech Group公司，Transwell小室(濾膜孔徑:8.0 μm)購自美國Corning公司，Matrigel膠購自美國BD公司，RPMI-1640 培養基、10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、L15培養基購自美國Gibco公司，Giemsa染色液購自江蘇省南京建成公司。

1.2 主要實驗設備 PCR儀購自美國ABI公司，光學顯微鏡及攝像系統購自德國Leica公司。

1.3 細胞來源與培養 人乳腺癌細胞株MDA-MB-231和MCF-7均購于中國科學院上海分院。MDA-MB-231細胞株用含10% FBS的L15培養基培養，MCF-7細胞株培養用含10% FBS的RPMI-1640培養基培養，2種細胞的培養條件均為37 ℃、5%CO2以及飽和濕度。每1～2 d傳代。

1.4 Transwell過程 預先準備4 ℃預冷的槍頭、EP管、Transwell小室和24孔板，實驗過程在冰上完成；將50 mg/L Matrigel與無血清培養液按1∶8體積混勻，用以包被Transwell小室底部膜的上室面，24孔板每孔用量為50 μL； 37 ℃放置約1 h ，使Matrigel聚合成凝膠；接種細胞， 培養60 h后觀察結果；計數6個視野(200×)，取平均值。

1.5 檢測2種細胞株中SLC22A18的 mRNA和蛋白的表達情況 采用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(real-time fluorescence quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測2種細胞株中SLC22A18 mRNA的表達情況：根據樣品Ct值計算出MDA-MB-231細胞株和MCF-7細胞株中SLC22A18 mRNA的表達量。采用Western blotting法檢測2種細胞株中SLC22A18蛋白的表達情況。

1.6 統計學處理 采用SPSS 16.0統計軟件進行統計學處理，SLC22A18 的mRNA和蛋白的表達水平的比較采用t檢驗，Transwell結果的比較采用秩和檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Transwell結果 MDA-MB-231和MCF-7細胞穿過Matrigel膠的細胞染色結果見圖1，穿過Matrigel膠的MDA-MB-231細胞Giemsa染色呈藍紫色、梭形；穿過Matrigel膠的MCF-7細胞Giemsa染色呈紫紅色、圓形。MDA-MB-231和MCF-7穿過Matirgel膠的平均細胞數分別為59.333個和20.000個；2組數據樣本呈偏態分布，秩和檢驗結果顯示差異有統計學意義(P<0.01)。由此表明，MDA-MB-231和MCF-7的侵襲能力有差異，惡性程度高的MDA-MB-231細胞株侵襲能力強，惡性程度低的MCF-7細胞株侵襲能力弱。見圖1。

圖1乳腺癌細胞株穿過Matrigel膠的細胞染色結果(×200)，白色箭頭為已穿透膜的細胞

2.2 SLC22A18的 mRNA和蛋白的表達 惡性程度高的MDA-MB-231細胞株中SLC22A18 的mRNA和蛋白表達水平較低，惡性程度低的MCF-7細胞株中SLC22A18 的mRNA和蛋白表達水平較高，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖2。

圖2乳腺癌細胞株SLC22A18mRNA和蛋白質表達

3 討 論

據統計，在全球范圍內，每年有120萬乳腺癌新發病例，危及10%～12%的女性人群，每年有50萬女性死于乳腺癌[5]。乳腺癌嚴重威脅婦女的健康，是女性因腫瘤導致死亡的首要原因，而乳腺癌的侵襲轉移則是導致患者死亡的首要原因。

以往關于腫瘤的的分子生物學研究多集中于基因的突變、序列的改變。然而，基因的表達除取決于DNA序列信息外，還取決于DNA甲基化、基因組印記等不涉及DNA序列的可遺傳的表達調控方式，這是目前醫學研究的熱點。

基因組印記是指特定親本的等位基因或其所在染色體在配子或受精卵中發生表觀遺傳學修飾，結果導致該基因的2個等位基因在其后代的子細胞中表達程度不同。基因組印記決定了性狀的遺傳不遵循孟德爾定律，而表現為單親依賴性遺傳。基因組印記在進化論意義上可能有防止單性生殖、維持遺傳多樣性的優勢，但也增加了隱性突變轉為顯性的危險性。由于印記基因相當于功能上的單倍體，單次突變就可使該基因失活，故可能導致疾病或腫瘤[6-7]。

印記基因導致腫瘤的機制主要有以下幾方面[8]：(1)印記獲得。原本雙表達的基因中有1個等位基因異常沉默，從而獲得了印記的特征，相當于功能上的單倍體，在某種程度上與雜合性缺失和單親二倍體相似，使罹患腫瘤的風險增加；(2) 失印記。促生長基因或癌基因的2個等位基因中的1個被印記沉寂，另1個正常表達，若印記的等位基因發生印記丟失(loss of imprinting，LOI)，導致雙等位基因表達，基因產物成倍增加，從而參與腫瘤的發生。如啟動腫瘤細胞生長的印記基因發生LOI，被印記的等位基因重新激活，可導致該基因過度表達，利于腫瘤生長。

SLC22A18，或稱TSSC5/IMPT1/BWR1A/ORCTL2，是位于人類染色體11p15.5的父源印記基因，與藥物敏感性、細胞代謝和生長有關[1]。SLC22A18蛋白水平可能受泛素-蛋白酶體途徑調節[9]。SLC22A18亦是成人肺腫瘤抑制基因和胎兒腎印記性腫瘤抑制基因[10]。研究[2-4]發現，人乳腺癌細胞中存在SLC22A18基因的突變，肝癌、乳腺癌中存在SLC22A18基因的印記獲得。

本研究發現，惡性程度較高的乳腺癌細胞株MDA-MB-231侵襲能力強，細胞中SLC22A18表達量較少；惡性程度低的乳腺癌細胞株MCF-7侵襲能力弱，細胞中SLC22A18表達量較多；這說明，印記基因SLC22A18有可能作為抑癌基因影響乳腺癌的侵襲轉移。SLC22A18在乳腺癌中表達下調的機制可能與基因發生突變或印記獲得有關。

綜上所述，SLC22A18的 mRNA和蛋白水平在惡性程度不同的乳腺癌細胞株MDA-MB-231和MCF-7中的差異有統計學意義。SLC22A18與乳腺癌細胞的侵襲能力有關，可能作為抑癌基因影響乳腺癌的侵襲轉移。

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[10]Lee MP, Brandenburg S, Landes GM, et al.Two novel genes in the center of the 11p15 imprinted domain escape genomic imprinting [J].Hum Mol Genet,1999, 8(4):683-690.