MMP-9及K iss-1在乳腺癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性分析

水一方，高艷麗，李孟圈

（1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 乳腺外一科 河南 鄭州 450000；2.鄭州市衛(wèi)生學(xué)校 藥理學(xué)教研室 河南 鄭州 450005）

MMP-9及K iss-1在乳腺癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性分析

水一方1，高艷麗2，李孟圈1

（1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 乳腺外一科 河南 鄭州 450000；2.鄭州市衛(wèi)生學(xué)校 藥理學(xué)教研室 河南 鄭州 450005）

目的：探討MMP-9和Kiss-1在乳腺癌組織中的表達(dá)情況及相關(guān)性。方法：選取乳腺浸潤性導(dǎo)管癌和癌旁正常乳腺組織標(biāo)本各60例，采用免疫組化S-P法檢測(cè)MMP-9、Kiss-1的表達(dá)情況，并對(duì)其與臨床病理因素的關(guān)系以及兩基因間的相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果：MMP-9在乳腺癌組織中的的陽性表達(dá)率為58.3％，明顯高于正常乳腺組織中的陽性率28.3％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Kiss-1在乳腺癌組織的陽性率為20.0％，低于癌旁組織的陽性表達(dá)率63.3％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。MMP-9的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)（P＜0.05），與年齡、腫塊的大小和組織學(xué)分級(jí)等因素?zé)o關(guān)（P＞0.05）。Kiss-1的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），與年齡、臨床分期、組織學(xué)分級(jí)及腫瘤大小無關(guān)（P＞0.05）。乳腺癌組織中Kiss-1表達(dá)與MMP-9表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.690，P＜0.05）。結(jié)論：MMP-9高表達(dá)及Kiss-1低表達(dá)可能與乳腺癌的浸潤、轉(zhuǎn)移有關(guān)，Kiss-1可能對(duì)MMP-9的表達(dá)具有抑制作用。

乳腺癌；細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶-9；Kiss-1基因；浸潤；轉(zhuǎn)移

乳腺癌現(xiàn)今已成為嚴(yán)重威脅女性健康的常見惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)涉及多基因、多階段的過程，侵襲和轉(zhuǎn)移是其重要的生物學(xué)行為，與預(yù)后密切相關(guān)。研究認(rèn)為，原發(fā)部位的腫瘤細(xì)胞可浸潤并穿透組織基底膜，避開機(jī)體的免疫監(jiān)視和反應(yīng)，通過血管和淋巴管進(jìn)入新的實(shí)質(zhì)組織，促使新的腫瘤血管形成，導(dǎo)致原發(fā)病灶以外的轉(zhuǎn)移灶的形成［1］。MMP-9是細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）家族中重要的成員之一，可以通過降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白中的膠原和非膠原成分而導(dǎo)致廣泛的組織損傷，從而導(dǎo)致腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。Kiss-1基因是Lee等［2］通過對(duì)黑色素瘤細(xì)胞株的研究發(fā)現(xiàn)和證實(shí)的一個(gè)新的抑癌基因。研究表明，其表達(dá)的降低或缺失與人類多種惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性。本研究通過檢測(cè) Kiss-1、MMP-9在乳腺癌組織及癌旁正常乳腺組織中的表達(dá)情況，探討它們與腫瘤細(xì)胞侵襲、浸潤生長及通過淋巴和血行發(fā)生轉(zhuǎn)移的生物學(xué)行為是否存在一定關(guān)聯(lián)，以期為乳腺癌患者的病情判斷和治療提供有價(jià)值的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2009年9月至2013年3月經(jīng)病理檢查確診為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌和癌旁4 cm以外正常乳腺組織的石蠟包埋標(biāo)本各60例，術(shù)前均未經(jīng)抗腫瘤治療（化療、放療、生物靶向治療）。患者年齡為18～81歲；絕經(jīng)前32例；絕經(jīng)后28例；腫瘤直徑為1.5～12.0 cm；腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性者33例，陰性者27例。乳腺癌TNM（tumor node metastasis）分期：Ⅰ期9例，Ⅱ期29例，Ⅲ期19例，Ⅳ期3例。組織學(xué)分級(jí)：Ⅰ期8例，Ⅱ期43例，Ⅲ期9例。

1.2 試劑與方法 采用免疫組化S-P法檢測(cè)Kiss-1、MMP-9在乳腺癌組織中的表達(dá)情況。兔抗人Kiss-1 metastin（45-54）-NH2單克隆抗體購自康肽生物科技（北京）有限公司；鼠抗人MMP-9單克隆抗體及相應(yīng)的二抗試劑盒，以及SP試劑均購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。用S-P法對(duì)全部乳腺癌及正常乳腺組織進(jìn)行免疫組化染色，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照試劑說明書操作進(jìn)行：將乳腺癌標(biāo)本和癌旁正常乳腺組織經(jīng)10％福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，采用免疫組化S-P法，PBS代替一抗作陰性對(duì)照，DAB顯色。

1.3 結(jié)果的判斷 染色后，在高倍視野下每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，共計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞，觀察其染色情況及陽性細(xì)胞百分比。MMP-9定位于細(xì)胞質(zhì)，以癌細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒判為陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)＞15％為陽性，陽性細(xì)胞數(shù)≤15％為陰性。Kiss-1蛋白主要定位于胞質(zhì)中，陽性染色為淡黃色、黃色以及棕褐色。根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行分級(jí)，評(píng)分采用二級(jí)計(jì)分與陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)法相結(jié)合的方法。根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比分為4類：5％～25％為1分，26％～50％為2分，51％～75％為3分，＞75％為4分；按染色強(qiáng)度分類：棕褐色為3分，黃色為2分，淡黃色為1分，以兩者得分?jǐn)?shù)乘積為總分，＞1判為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定性資料組間比較采用 χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MM P-9及K iss-1在不同乳腺組織中的表達(dá)情況 MMP-9在乳腺癌組織中的的陽性表達(dá)率為58.3％（35/60），明顯高于正常乳腺組織中的陽性率28.3％（17/60），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Kiss-1在乳腺癌組織的陽性率為20.0％（12/60），低于癌旁組織的陽性表達(dá)率63.3％（38/60），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 MM P-9及K iss-1表達(dá)與乳腺癌臨床及病理因素的關(guān)系 MMP-9的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)（P＜0.05），與年齡、腫塊的大小和組織學(xué)分級(jí)等因素?zé)o關(guān)（P＞0.05）。Kiss-1的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），與年齡、臨床分期、組織學(xué)分級(jí)及腫瘤大小無關(guān)（P＞0.05）。見表1。

2.3 K iss-1與MM P-9表達(dá)的相關(guān)性 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，乳腺癌組織中Kiss-1表達(dá)與MMP-9表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.690，P＜0.05）。見表2。

3 討論

乳腺癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是影響患者預(yù)后的重要因素，癌細(xì)胞對(duì)基底膜的破壞是其向鄰近纖維結(jié)締組織浸潤和向遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移過程的最基本步驟。正常組織基底膜對(duì)一般上皮細(xì)胞具有一定的阻擋作用，即便在炎癥、組織愈合、重建等特殊的病理生理變化時(shí)，細(xì)胞可以暫時(shí)穿透基膜，但組織可通過自我修復(fù)而恢復(fù)其完整性。

表1 MMP-9及Kiss-1的表達(dá)與乳腺癌臨床及病理因素的關(guān)系

表2 乳腺癌組織中Kiss-1與MMP-9表達(dá)的相關(guān)性

MMP-9也稱明膠酶B，是一種蛋白水解酶，其特有的功能域能高效降解Ⅳ型膠原。正常的基膜是細(xì)胞外結(jié)構(gòu)，是由Ⅳ型膠原參與組成的一層嚴(yán)密、均一的穩(wěn)固而密實(shí)的防護(hù)層。Ⅳ型膠原對(duì)維持基膜的完整性起著十分重要的作用。在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中有不同程度的基膜缺損，為腫瘤局部生長、侵襲以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了一定的條件［3］。本研究顯示，MMP-9在乳腺癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；隨臨床分期的提高，MMP-9的陽性率也越來越高。越高的臨床分期往往提示腫瘤細(xì)胞具有更高的侵襲力，甚至在發(fā)病時(shí)已伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶，復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)也往往隨著臨床分期的提高而增大。此外，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性率也明顯高于無轉(zhuǎn)移組，表明MMP-9可能在乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中起到重要作用，而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況現(xiàn)今已成為指導(dǎo)臨床治療的重要指標(biāo)。這些都提示檢測(cè)MMP-9的表達(dá)或許有助于對(duì)乳腺良惡性疾病的鑒別，同時(shí)也有望成為預(yù)判乳腺癌的惡性程度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移潛能的可靠指標(biāo)，從而為臨床診療工作提供更多的實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

Kiss-1基因已被證實(shí)為一種抑癌基因，Kiss-1表達(dá)的缺失與黑色素瘤、膀胱癌以及子宮內(nèi)膜癌等腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系已得到證實(shí)［4-5］。Lee等［2］發(fā)現(xiàn)，通過對(duì)實(shí)驗(yàn)組裸鼠接種Kiss-1過表達(dá)的人乳腺癌細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移降低了95％，這是首例經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)的Kiss-1能夠抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移。后續(xù)的研究則發(fā)現(xiàn)，Kiss-1在高侵襲性的乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)存在缺失情況［6］；且乳腺癌細(xì)胞經(jīng)Kisspepetin處理后，細(xì)胞侵襲力明顯減弱，骨轉(zhuǎn)移可被抑制［7］。本研究結(jié)果顯示，癌旁正常乳腺組織Kiss-1的陽性率明顯高于乳腺癌組織中的陽性率，說明乳腺癌的發(fā)生與Kiss-1的表達(dá)缺失或失活存在相關(guān)性。淋巴轉(zhuǎn)移組Kiss-1的陽性表達(dá)明顯低于無轉(zhuǎn)移組，隨著臨床分期的進(jìn)展，陽性表達(dá)下降，這些提示該基因可能參與了乳腺癌轉(zhuǎn)移的調(diào)控，并且具有抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的潛能。Kostadima等［8］在272例伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌原發(fā)灶組織中僅檢測(cè)到8例有Kiss-1的表達(dá)，提示在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌病例中確實(shí)存在Kiss-1表達(dá)缺失的情況；此外，Kiss-1基因在乳腺癌伴有腦轉(zhuǎn)移灶的病例中表達(dá)較原發(fā)病灶明顯降低，而Kiss-1高表達(dá)的病例無轉(zhuǎn)移生存期更長［9］。

Kiss-1可通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）相關(guān)通路阻止細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜被降解，從而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。現(xiàn)研究表明，在乳腺癌組織中Kiss-1與MMP-9的表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)。其機(jī)制可能為：Kiss-1抑制了nf-κb途徑，上調(diào)nf-κb抑制物，使胞漿中nf-κb的核內(nèi)轉(zhuǎn)移受到抑制，導(dǎo)致與MMP-9啟動(dòng)子結(jié)合的nf-κb減少，從而使MMP-9表達(dá)下調(diào)，從而抑制乳腺癌或其他腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［10］。本研究結(jié)果顯示，Kiss-1的表達(dá)與MMP-9的表達(dá)存在負(fù)相關(guān)，這或許可以說明Kiss-1作為一類基因可以通過對(duì)MMP-9的表達(dá)調(diào)控而參與乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，但限于本實(shí)驗(yàn)病例數(shù)的限制，更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕Y(jié)論應(yīng)該通過大量、長期的研究而得出。

通過該研究表明，MMP-9及Kiss-1表達(dá)的上調(diào)和下調(diào)均與乳腺癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移有關(guān)。在未來的臨床實(shí)踐中，如能同時(shí)兼顧二者的檢測(cè)，或許有助于篩選高危患者，制定更為合理有效的治療方案，甚至可輔助鑒別乳腺癌及良性乳腺疾病。

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Expression and correlation of matrix metalloproteinase-9 and K iss-1 in breast cancers

SHUIYifang1，GAO Yanli2，LIMengquan1

（1.The First Department of Breast Surgery，the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450000，China；2.Department of Pharmacology，Zhengzhou Health School，Zhengzhou 450000，China）

Objective：To study the expression ofmatrix metalloproteinase-9（MMP-9）and Kiss-1 and the correlation in breast cancer.Methods：The expression of MMP-9 and Kiss-1 was detected by immunohistochemistry streptavidin-peroxidase method in 60 cases of breast cancer and 60 cases of normal tissue adjacent to tumor.The relationship between MMP-9，Kiss-1 and clinicopathologic features of breast cancer was analyzed.The correlation of MMP-9 and Kiss-1 was analyzed.Results：The positive expression rate of MMP-9 in breast cancer was 58.3％，much higher than normal breast tissues with 28.3％（P＜0.05）.The positive expression rate of Kiss-1 in breast cancer was 20.0％，lower than normal breast tissues with 63.3％（P＜0.05）.The expression of MMP-9 was related to lymph node metastasis and clinical stage but unrelated with age，histological stage and the size of tumor.The expression of Kiss-1 was related to lymph nodemetastasis but unrelated with with age，clinical stage，histological stage and the size of tumor.The expression of MMP-9 was negatively correlated with the expression of Kiss-1 in tissues of breast cancer.Conclusion：The high expression of MMP-9 and low expression of Kiss-1 may be related to the metastasis and invasion of breast carcinoma，and Kiss-1 may inhibit the expression of MMP-9.

breast cancer；matrix metalloproteinase-9；Kiss-1 gene；invasion；metastasis

R 737.9

10.3969/j.issn.1004-437X2014.11.003

李孟圈，E-mail：lmql0332@126.com。

2014-08-23）