乳腺癌T細胞受體α鏈全長編碼序列多重PCR擴增方法的建立

張建波，呂曉東，楚廣民，宋 魏，馮 穩(wěn)，劉明閣，于慶凱

（鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院 病理科 河南 鄭州 450003）

乳腺癌T細胞受體α鏈全長編碼序列多重PCR擴增方法的建立

張建波，呂曉東，楚廣民，宋 魏，馮 穩(wěn)，劉明閣，于慶凱

（鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院 病理科 河南 鄭州 450003）

目的：建立乳腺癌克隆性T細胞TCRα鏈全長編碼序列（CDS）的多重PCR擴增方法。方法：根據GenBank現有TCR序列設計擴增TCRα鏈32個亞家族上游引物35條，下游引物2條。對Mg2+、dNTPs和引物濃度比例以及退火溫度進行優(yōu)化，確定最佳反應體系進行TCRα鏈多重PCR擴增，構建重組質粒并酶切鑒定。結果：擴增出乳腺癌轉移淋巴結中的TCRα鏈全長編碼序列并構建重組質粒，5例患者共獲得23個陽性克隆。結論：建立的TCRα鏈多重PCR擴增方法具有特異、快速、簡便的特點，可為研究乳腺癌克隆性T細胞提供幫助。

T細胞受體；多重PCR；質粒

近年來，乳腺癌發(fā)病率呈上升趨勢，約占女性惡性腫瘤的30％，占女性惡性腫瘤致死率的15％左右［1］。乳腺癌患者轉移淋巴結中存在針對腫瘤抗原特異反應的T細胞克隆，分析這些克隆性增生的 T細胞，可以了解機體TCR亞家族限制性取用及CDR3譜型等機體抗腫瘤免疫應答情況［2］。由于TCRα鏈由Vα-Jα-Cα基因片斷重排后編碼，構成具有不同特異性的TCR分子，由此決定 T細胞識別抗原的多樣性和特異性，從而可對環(huán)境中千變萬化的抗原產生特異性應答［3］。本研究的目的是建立特異、快速、簡便的多重PCR擴增方法擴增TCRα鏈全長編碼序列，為分析乳腺癌患者轉移淋巴結中克隆性增生 T細胞的特點等進一步研究提供幫助。

1 材料和方法

1.1 標本 選取河南省腫瘤醫(yī)院確診為乳腺浸潤性導管癌（組織學II級）住院患者5例，均為女性，年齡28～73歲，經術中快速冰凍檢查明確腋窩前哨淋巴結有癌微轉移標本。同時取2例反應性增生淋巴結標本作為對照。

1.2 材料 TRIzol、SuperScript III Reverse Transcriptase（美國Invitrogen公司），Advantage 2 Polymerase M ix（美國BD公司），Taq DNA Polymerase、Restriction Endonucleases（Xbal、EcoRⅠ、KpnⅠ）、T4 DNA Ligase、pGEM-7Zf（+）Vector（美國Promega公司），E.Z.N.A Plasmid Miniprep Kit（美國Omega公司），QIAEX II Gel Extraction Kit（德國QIAGEN公司），PCR儀（美國MJ research公司）。

1.3 RNA提取及cDNA合成 將癌轉移淋巴結周圍的淋巴組織及對照組淋巴結標本在200目篩網上進行研磨后用PBS進行沖洗，收集細胞懸液并計數，提取總RNA合成20μl cDNA。

1.4 引物的設計 根據GenBank現有TCR序列設計TCRα鏈的上游引物35條，下游引物2條［4］。上游引物分別引入KpnⅠ和EcoRⅠ限制性內切酶識別序列，下游引物引入 Xbal限制性內切酶識別序列。并將TCRα鏈終止密碼TGA改為TAA以避免甲基化（引物由上海英俊生物技術公司合成）。

1.5 多引物PCR分別擴增TCRα鏈全長序列 根據退火溫度不同分為 7組，每組引物 4～12對。各PCR反應體系中引物濃度、退火溫度及Mg2+濃度分別經梯度PCR進行優(yōu)化，引物終濃度是10μmol/L，Mg2+終濃度1.5 mmol/L，退火溫度在50～65℃?？偡磻w系50μl，其中10×Buffer 5μl，MgCL23μl，dNTP 1μl，上、下游混合引物各0.5μl，cDNA 1μl，Taq酶（5u/μl）0.5μl，各反應體系引物終濃度是10μmol/L，Mg2+終濃度1.5 mmol/L。反應條件為：預變性95℃5 min；95℃40 s，50～65℃1 min，72℃1 m in 50 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產物上1％瓊脂糖凝膠電泳。

1.6 構建重組質粒及酶切鑒定 PCR陽性產物純化回收后經Kpn I和Xbal、EcoRI和Xbal酶切，與相應酶切質粒pGEM-7Zf（+）進行連接反應并轉化感受態(tài)細胞E.coli JM109，挑取氨芐青霉素抗性菌落，增菌培養(yǎng)后提取質粒，酶切并上1％瓊脂糖凝膠電泳。

2 結果

2.1 TCRα鏈全長序列的多重PCR擴增 將多重PCR擴增產物上1％瓊脂糖凝膠電泳，部分擴增體系在800 bp左右有目的條帶，對照組反應性增生淋巴結標本各反應體系均有擴增，見圖1。

1～5：TCRα鏈多重PCR擴增產物；6：陰性質控；M：DNA分子量標準。

2.2 重組質粒的PCR、酶切鑒定 陽性克隆酶切電泳可見兩條泳動速度不同的條帶，分別與PCR擴增產物和空質粒雙酶切后的大小一致，見圖2。經鑒定5例患者分別獲得陽性克隆數為5個、4個、4個、5個、5個，共23個陽性克隆。

圖2 TCRα鏈PCR產物及重組質粒酶切鑒定

3 討論

TCR是T細胞表面的抗原受體，參與抗原的特異性識別。編碼TCRα鏈的基因由許多不連續(xù)的可變區(qū)基因（AV），連接基因（AJ）和恒定區(qū)基因（AC）組成。根據TCR AV核苷酸同源性是否大于75％，可以把TCR AV分為32個功能性基因家族。AV基因片段的下游有50～70個AJ基因片段和1個AC基因片段［3］。分析乳腺癌患者體內 T細胞的克隆性增生情況及其CDR3譜型，可反映特定T細胞克隆擴增的程度及T細胞抗腫瘤免疫功能狀態(tài)［5］。

本研究建立克隆性T細胞的多重PCR方法，擴增TCRα鏈全長序列，具有快速、特異、簡便的優(yōu)點。但是多重PCR并非單一引物對PCR的簡單組合，其中Mg2+、dNTPs、引物濃度、退火溫度、酶的用量以及循環(huán)條件等均需進行優(yōu)化。經梯度PCR摸索反應條件，顯示較低引物濃度可減少非特異條帶的擴增。適當降低退火溫度，延長變性、退火、延伸時間，增加變性溫度、循環(huán)時間和循環(huán)次數可以有效地增加PCR產物的產量，而Mg2+、dNTPs的濃度、酶的用量則與單獨擴增時相似。

利用該方法對5例乳腺癌轉移淋巴結TCRα鏈進行擴增，構建重組質粒經酶切鑒定共獲得23個陽性T細胞克隆，與PCR-序列分析方法相比一定程度上減少了工作量，由于擴增的是TCRα鏈全長編碼序列，可進一步完整地分析所有核苷酸和氨基酸序列，擴增的序列還可用于體外表達，避免了PCR-GeneScan（基因掃描）-序列分析［6］只擴增 TCR部分序列的不足，而且不受CDR3長度的影響，為研究腫瘤相關T細胞克隆，以及分析其TCR基因重排和CDR3譜型等打下了基礎。

［1］Jemal A，Siegel R，Xu J，et al.Cancer Statistics［J］.CA Cancer J Clin，2010，60（5）：277-300.

［2］張建波，宋永平，于慶凱，等.乳腺癌患者T細胞受體基因重排及CDR3區(qū)序列分析［J］.腫瘤研究與臨床，2010，22（3）：179-181.

［3］Srivastava S K，Robins H S.Palindromic nucleotide analysis in human T cell receptor rearrangements［J］.PLoS One，2012，7（12）：e52250.

［4］張建波，方毅敏，黃艷，等.活動性肺結核患者α/βTCR基因重排及CDR3譜型分析［J］.中國免疫學雜志，2007，23（12）：1136-1139.

［5］Zhang M，Maiti S，Bernatchez C，et al.A new approach to simultaneously quantify both TCRα-andβ-chain diversity after adoptive im-munotherapy［J］.Clin Cancer Res，2012，18（17）：4733-4742.

［6］Blohm JH，Blohm N，Hummel M，et al.Detection of clonal T-cellreceptor（TCR）Vbeta rearrangements in exp lanted dilated cardiomyopathy hearts by semi-nested PCR，GeneScan，and direct sequencing［J］.Med Sci Monit Basic Res，2013，（19）：111-117.

Establishment of M ulti-PCR to am p lify the com plete DNA sequence of TCRαchains in patients w ith breast cancer

ZHANG Jianbo，LV Xiaodong，CHU Guangm in，SONG Wei，FENG Wen，LIU Mingge，YU Qingkai
（Department of Pathology，the Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450003，China）

Objective：To establish a method of Multi-PCR to amplify the complete DNA sequence（CDS）of TCRαchains of clonal T cells in patientswith breast cancer.M ethods：The specific 35 upstream primers and 2 downstream primers for 32 subfam ilies were designed according to the sequences of TCRαchains provided by GeneBank.The multiplex PCR reaction system and condition was optimized to find out the best concentration of Mg2+，dNTPs and primers，and the best annealing temperature.The CDS of TCRαchains were amplified and then inserted into cloning vector.The recombinant constructs were identified by the endonucleases.Resu lts：The CDS of TCRαchains were amplified，and constructed the recombinant plasmid.There were 23 positive clones were received in 5 patients with breast cancer.Conclusion：Multi-PCR established in the study is specific，rapid，simple and convenient.It provides the technical support to analyse the Feature of clonal T cell in patients with breast cancer.

T-cell antigen receptor（TCR）；Multi-PCR；plasmid

河南省基礎與前沿技術研究計劃項目（102300410038）。

于慶凱，E-mail：yuqingkai@hot.mail。

R 737.9

10.3969/j.issn.1004-437X2014.11.002

2014-06-15）