重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血Fas系統(tǒng)的影響

夏晨輝，吳曉巖，彭晨星，魏偉華，韓玉祥，靳洪濤，郭惠芳(.哈勵遜國際和平醫(yī)院藥學(xué)部，河北 衡水 05000；.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，河北 石家莊 050000；.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院免疫風(fēng)濕科，河北 石家莊 050000；.河北省任丘市人民醫(yī)院內(nèi)科，河北 任丘 06550)

·論著·

重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血Fas系統(tǒng)的影響

夏晨輝1，吳曉巖2，彭晨星3*，魏偉華4，韓玉祥3，靳洪濤3，郭惠芳3
(1.哈勵遜國際和平醫(yī)院藥學(xué)部，河北 衡水 053000；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，河北 石家莊 050000；3.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院免疫風(fēng)濕科，河北 石家莊 050000；4.河北省任丘市人民醫(yī)院內(nèi)科，河北 任丘 062550)

目的通過檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)患者在應(yīng)用注射用重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白(recombinant human tumor necrosis factor receptor-Fc fusion protein，rhTNFR∶Fc)治療前后外周血T淋巴細(xì)胞Fas/Fas L水平的變化情況，了解rhTNFR∶Fc對RA患者外周血T淋巴細(xì)胞凋亡的影響。方法RA患者64例為治療組，并隨機分為3個亞組，甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)組17例，rhTNFR∶Fc組25例，MTX+rhTNFR∶Fc治療組22例；并選擇正常體檢者18例作為對照組。各組分別抽取rhTNFR∶Fc治療前后靜脈血檢測Fas/Fas L的水平，記錄所有RA患者28個關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)壓痛數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)，檢測紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR，魏氏法)、類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor,RF-IgM，比濁法)，并計算28個關(guān)節(jié)疾病活動指數(shù)(disease activity score 28,DAS28)。結(jié)果各組RA患者治療前外周血中關(guān)節(jié)壓痛數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)、ESR、RF、DAS28、Fas、Fas L、Fas/Fas L水平均比正常對照組明顯增高，治療后各指標(biāo)均明顯下降，其中MTX+rhTNFR∶Fc組較其余2組更為顯著(P<0.01)。RA患者在接受rhTNFR∶Fc治療后，F(xiàn)as/Fas L與ESR、RF、DAS28呈正相關(guān)(r=0.441、0.527、0.466，P<0.01)。結(jié)論rhTNFR∶Fc可以通過抑制活化的T淋巴細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子α，下調(diào)RA外周血淋巴細(xì)胞Fas系統(tǒng)的表達(dá)，最終達(dá)到抗風(fēng)濕的作用。

關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕；受體，腫瘤壞死因子，Ⅱ型；T淋巴細(xì)胞

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以持續(xù)的滑膜炎、多關(guān)節(jié)骨與軟骨破壞為特征的系統(tǒng)性自身免疫性疾病。外周血T淋巴細(xì)胞的凋亡在RA發(fā)病機制中占有非常重要的地位[1]。細(xì)胞凋亡是一種由基因控制的細(xì)胞自主性死亡方式，F(xiàn)as系統(tǒng)是引起細(xì)胞凋亡的主要途徑之一。Fas屬于腫瘤壞死因子/神經(jīng)生長因子受體家族成員，廣泛分布于活化的T、B淋巴細(xì)胞，某些上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中也有表達(dá)。Fas L是Fas在人體內(nèi)的天然配體,Fas和Fas L相互作用是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要途徑，當(dāng)Fas與Fas L結(jié)合時，將信號傳遞到胞質(zhì)區(qū)，致Fas的死亡域結(jié)構(gòu)活化，介導(dǎo)表達(dá)Fas的細(xì)胞凋亡[2]。注射用重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白(recombinant human tumor necrosis factor receptor-Fc fusion protein，rhTNFR∶Fc)可競爭性地與血中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)結(jié)合，阻斷其與細(xì)胞表面TNF-α受體結(jié)合，降低其活性，是治療RA的新一代改善病情藥物。本研究擬通過檢測RA患者在應(yīng)用rhTNFR∶Fc治療前后外周血T淋巴細(xì)胞Fas/Fas L水平的變化情況，了解rhTNFR∶Fc對RA患者外周血T淋巴細(xì)胞凋亡的影響，探討其治療RA的可能作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選擇2012年1月—2013年11月在河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院確診的RA患者64例為治療組，均符合美國風(fēng)濕病協(xié)會1987年修訂的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)，男性16例，女性48例；年齡19～53歲，平均(35.2±10.5)歲；病程1.2～8.7年，平均(3.5±1.3)年。并選擇體檢中心體檢的健康志愿者18例為對照組，男性6例，女性12例；年齡20～51歲，平均(32.6±7.4)歲；需詢問病史、體格和常規(guī)生化檢查、心電圖和正位胸部X線片等輔助檢查，無器質(zhì)性疾病，而且既往無RA及其他自身免疫性疾病。2組性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。治療組隨機分為3個亞組，甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)組17例，rhTNFR∶Fc組25例，MTX+rhTNFR∶Fc組22例。研究符合醫(yī)院人體試驗倫理委員會所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)并得到該委員會的批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。MTX組口服MTX10mg/次，每周1次，共用12周；rhTNFR∶Fc組皮下注射rhTNFR∶Fc 25mg/次，每周2次，共用12周；MTX+rhTNFR∶Fc組為上述2種藥物聯(lián)合應(yīng)用，劑量同上，共用12周。

1.2 試劑與儀器：注射用rhTNFR∶Fc(商品名益賽普，批準(zhǔn)文號S20050058，12.5mg/支)購于上海中信國建制藥有限公司，注射用MTX(10mg/支)購于上海華聯(lián)制藥有限公司，PE-Fas及PE-Fas L購于美國CALTAG公司，F(xiàn)ITC-IgG1及PE-Ig G2α購于美國Pharmigen公司，RF試劑盒均購于歐蒙(杭州)醫(yī)學(xué)實驗診斷有限公司，細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Forma公司，TNZ1FORMA3111)，流式細(xì)胞儀(美國BD公司，F(xiàn)ACS Calibur)。

1.3 方法：收集所有受試者肝素抗凝靜脈血0.5～1.0mL。在流式專用試管內(nèi)加入抗Fas單抗-PE、抗Fas L單抗-PE及同型對照IgG2a PE各10μL，然后加入50μL抗凝全血混勻，室溫避光反應(yīng)20min。加入溶血素溶血500μL，渦旋混勻，室溫避光12min，反應(yīng)完畢后用PBS洗滌1次，加PBS 3mL。離心機1 000r/min離心5min，棄上清液，留沉淀上機檢測。以Cellquest軟件進(jìn)行樣本的攝取及分析，共記錄10 000個細(xì)胞。圈定淋巴細(xì)胞群進(jìn)行Fas及Fas L分析。結(jié)果以雙參數(shù)散點圖(dot plot)顯示，由流式細(xì)胞儀附帶軟件處理給出結(jié)果。

1.4 觀察指標(biāo)：分別抽取RA患者rhTNFR∶Fc治療前后靜脈血檢測Fas/Fas L的水平，記錄RA患者28個關(guān)節(jié)(28個關(guān)節(jié)包括腕、肘、肩、膝關(guān)節(jié)各2個，雙手近指關(guān)節(jié)及掌指關(guān)節(jié)各10個)的關(guān)節(jié)壓痛數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)，檢測紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR，魏氏法)、類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor,RF-IgM，比濁法)，并計算28個關(guān)節(jié)疾病活動指數(shù)(disease activity score 28,DAS28)。DAS28包括人體28個關(guān)節(jié)的壓痛計數(shù)、腫脹計數(shù)、ESR的水平以及患者的自身綜合評估(最近7d患者RA病情活動性，用0～100mm表示，數(shù)值越大，活動性越大)。DAS28=0.56×SQRT(T28)+0.28×SQRT(SW28)+0.70×LN(ESR)+0.014×GH。

2 結(jié) 果

2.1 脫落病例和不良反應(yīng)：治療組共完成試驗59例，脫落5例，其中MTX組2例，rhTNFR∶Fc組1例，MTX+rhTNFR∶Fc組2例。共發(fā)生不良事件4例，無嚴(yán)重不良事件發(fā)生，其中MTX組2例[1例為白細(xì)胞減低(3.31×109/L)，1例為肝功能損傷(丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶62U/L，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶56U/L)]，rhTNFR∶Fc組1例為皮膚注射處紅腫，MTX+rhTNFR∶Fc組1例為白細(xì)胞減低(3.2×109/L)。各組不良反應(yīng)均未影響本試驗研究。

2.2 4組觀察指標(biāo)比較：3個亞組患者治療前關(guān)節(jié)壓痛數(shù)和關(guān)節(jié)腫脹數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，治療后MTX+rhTNFR∶Fc組關(guān)節(jié)壓痛數(shù)明顯少于MTX組和rhTNFR∶Fc組(P<0.05)；關(guān)節(jié)腫脹數(shù)rhTNFR∶Fc組少于MTX組(P<0.05)，MTX+rhTNFR∶Fc組少于rhTNFR∶Fc組(P<0.01)；治療前3個亞組ESR、RF、DAS28、Fas、Fas L和Fas/Fas L均高于對照組(P<0.05)，而3個亞組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，治療后3個亞組ESR、RF、DAS28、Fas、Fas L和Fas/Fas L較治療前均明顯降低(P<0.05)；3個亞組各指標(biāo)較正常對照組有升有降，但最接近正常對照組的是MTX+rhTNFR∶Fc組組，其次和rhTNFR∶Fc組。見表1。

2.3 相關(guān)分析：RA患者在接受rhTNFR∶Fc治療后，F(xiàn)as/Fas L與ESR、RF、DAS28呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(r=0.441、0.527、0.466，P<0.01)。

組別例數(shù)關(guān)節(jié)壓痛數(shù)(個)治療前治療后關(guān)節(jié)腫脹數(shù)(個)治療前治療后正常對照組180000MTX組159．67±2．155．37±1．94☆6．13±1．543．96±1．45☆rhTNFR∶Fc組249．17±2．415．19±2．04☆5．42±1．583．18±1．57#☆MTX+rhTNFR∶Fc組209．65±2．513．68±2．17#△☆5．85±1．352．19±1．26△☆ F值0．2993．9161．1134．452 P值0．7420．0260．3360．016組別例數(shù)ESR(mm/1h)治療前治療后RF(kU/L)治療前治療后正常對照組187．56±3．737．56±3．734．32±2．294．32±2．29MTX組1554．87±13．34?22．54±15．97?☆245．81±82．14?131．27±63．52?☆rhTNFR∶Fc組2449．12±12．69?22．78±17．83?☆276．43±93．55?124．58±72．49?☆MTX+rhTNFR∶Fc組2052．62±12．17?15．82±11．16☆235．12±85．67?76．62±59．57?#△☆ F值71．8025．42549．44118．464 P值0．0000．0020．0000．000組別例數(shù)DAS28治療前治療后Fas(%)治療前治療后正常對照組181．41±1．331．41±1．3319．35±5．2619．35±5．26MTX組156．24±2．26?3．31±1．43?☆54．38±7．86?4．32±8．54?☆rhTNFR∶Fc組245．63±1．94?3．46±1．37?☆51．47±8．29?23．63±7．47?☆MTX+rhTNFR∶Fc組205．76±2．25?2．05±1．06?#△☆53．52±8．62?16．58±8．11#△☆ F值23．35812．1687．8185．254 P值0．0000．0000．0000．002組別例數(shù)FasL(%)治療前治療后Fas/FasL治療前治療后正常對照組181．53±0．661．53±0．6612．26±3．4712．26±3．47MTX組153．45±0．78?1．88±0．64☆22．78±2．96?13．63±2．57?☆rhTNFR∶Fc組243．74±0．85?1．92±0．73☆24．48±3．38?14．21±3．13?☆MTX+rhTNFR∶Fc組203．66±0．74?1．35±0．67△☆24．52±3．24?9．58±2．06?#△☆ F值35．2123．31960．21616．633 P值0．0000．0240．0000．000

*P<0.01與正常對照組比較 #P<0.05與MTX組比較 △P<0.05與rhTNFR∶Fc組比較 ☆P<0.05與治療前比較(q檢驗或配對t檢驗)
MTX：methotrexate；rhTNFR∶Fc：recombinant human tumor necrosis factor receptor-Fc fusion protein；ESR：erythrocyte sedimentation rate；RF：rheumatoid factor；DAS28：disease activity score 28

3 討 論

抗原通過抗原提呈細(xì)胞激活T細(xì)胞，致炎性細(xì)胞因子等炎癥介質(zhì)產(chǎn)生增多，進(jìn)而引起滑膜炎、血管炎、軟骨及骨破壞等RA的特征性病理變化。淋巴細(xì)胞凋亡在RA發(fā)病過程中的變化有助于進(jìn)一步明確其發(fā)病機制[3]。隨著RA生物技術(shù)的進(jìn)展和對發(fā)病機制的研究，出現(xiàn)了生物慢作用抗風(fēng)濕藥，生物制劑可以抑制促炎因子，在炎癥過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。TNF-α抑制劑在改善臨床療效及生活質(zhì)量、實現(xiàn)RA的低疾病活動度和目標(biāo)治療方面有著非常突出的優(yōu)勢[4-5]。

本研究結(jié)果顯示，rhTNFR∶Fc能夠下調(diào)外周血淋巴細(xì)胞Fas、Fas L水平，并且與MTX作用相當(dāng)，二者聯(lián)用可以增加其調(diào)控Fas系統(tǒng)的作用，同時也明顯改善關(guān)節(jié)腫脹及壓痛數(shù)、ESR、RF、DAS28等炎癥指標(biāo)的水平，緩解RA的臨床癥狀。

Fas系統(tǒng)可以誘導(dǎo)機體免疫細(xì)胞凋亡，是一種主動的、生理的細(xì)胞死亡方式，是機體清除活化的淋巴細(xì)胞，保證細(xì)胞群體數(shù)量穩(wěn)態(tài)、維持免疫系統(tǒng)功能的重要手段。RA患者外周血淋巴細(xì)胞活化后可以產(chǎn)生多種炎癥因子如TNF-α、白細(xì)胞介素4等，刺激滑膜產(chǎn)生炎癥，生成滑膜血管翳，是造成關(guān)節(jié)破壞、畸形及功能障礙的病理基礎(chǔ)。Chou等[6]發(fā)現(xiàn)在RA患者中Fas/Fas L的水平較骨關(guān)節(jié)炎患者明顯升高。Cha等[7]和García等[8]研究表明，滑膜細(xì)胞凋亡障礙可以導(dǎo)致滑膜細(xì)胞增殖和凋亡間平衡失調(diào)，引起RA關(guān)節(jié)滑膜組織過度增生，進(jìn)而導(dǎo)致受累關(guān)節(jié)炎癥、功能減退及畸形。Fas系統(tǒng)對RA發(fā)病的影響以及給予慢作用抗風(fēng)濕藥后可以改善其對RA的誘導(dǎo)[9-10]。

TNF-α是RA、銀屑病、強直性脊柱炎等病理過程中的一個主要炎性介質(zhì)，其參與調(diào)控的炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致關(guān)節(jié)的病理改變。rhTNFR∶Fc是新一代的生物制劑抗風(fēng)濕藥物，隨著近年來的廣泛應(yīng)用，對其影響細(xì)胞凋亡方面也有許多研究。Gorak-Stolinska等[11]證實，rhTNFR∶Fc可以抑制Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而增加人原效應(yīng)T細(xì)胞易感性并進(jìn)一步活化誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，而且Th1和Tc1的細(xì)胞比Th2細(xì)胞更易發(fā)生死亡，其機制可能是抑制了參與炎癥介質(zhì)分泌的一種端粒酶。Fries等[12]研究rhTNFR∶Fc對實驗性結(jié)腸炎小鼠腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡的早期影響，發(fā)現(xiàn)rhTNFR∶Fc可以抑制回腸黏膜上皮Fas L的表達(dá)，而抗凋亡蛋白Bcl-2水平則在疾病早期即出現(xiàn)快速升高，證實其可能通過抑制外周循環(huán)TNF-α水平來達(dá)到抑制凋亡的作用。Mazzon等[13]評估TNF-α對TNF-α受體1基因敲除小鼠炎性疾病的發(fā)病機制時發(fā)現(xiàn)，TNF-αR1KO小鼠顯著減少炎癥部位滲出液的積聚和炎癥細(xì)胞的數(shù)量，同時Fas L也顯著降低，并且對炎癥小鼠注射rhTNFR∶Fc后同樣達(dá)到降低Fas L、抑制細(xì)胞凋亡的作用。總之，rhTNFR∶Fc可以通過抑制活化的T淋巴細(xì)胞分泌TNF-α，通過某種調(diào)控來下調(diào)RA外周血淋巴細(xì)胞Fas系統(tǒng)的表達(dá)，最終達(dá)到抗風(fēng)濕的作用。

近期的研究[14]表明，rhTNFR∶Fc不管是單用還是與MTX聯(lián)用，都非常安全和有效，隨著對其作用機制的進(jìn)一步明確，必將在RA治療中得到更好的應(yīng)用。

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(本文編輯：趙麗潔)

2014-03-12；

2014-04-11

河北省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)重點科研計劃(20110356)

夏晨輝(1972-)，女，河北景縣人，衡水市哈勵遜國際和平醫(yī)院主管藥師，理學(xué)學(xué)士，從事臨床藥理學(xué)研究。

*通訊作者。E-mail：peng2307@126.com

R593.22

B

1007-3205(2014)06-0706-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.06.031