人卵巢黃素化顆粒細胞端粒酶活性與卵巢反應性及胚胎質量的關系

趙志明，崔 娜，郝桂敏，徐素欣(河北醫科大學第二醫院生殖醫學中心，河北 石家莊 050000)

·論著·

人卵巢黃素化顆粒細胞端粒酶活性與卵巢反應性及胚胎質量的關系

趙志明，崔 娜，郝桂敏，徐素欣
(河北醫科大學第二醫院生殖醫學中心，河北 石家莊 050000)

目的探討體外受精-胚胎移植中人卵巢黃素化顆粒細胞端粒酶的活性與相應卵巢反應性和胚胎質量的關系。方法收集56例行體外受精-胚胎移植患者卵泡液中的黃素化顆粒細胞，并進行體外培養；根據卵泡數不同分為低反應組、中反應組和高反應組；又根據優質胚胎率不同分為低質量組和高質量組。端粒重復序列擴增酶聯免疫吸附分析法測定顆粒細胞端粒酶活性，并比較低反應組、中反應組與高反應組以及低質量組與高質量組顆粒細胞端粒酶的活性。結果分離提純的人黃素化顆粒細胞于24h內貼壁生長良好。隨著患者的年齡、使用促性腺激素量的增加，端粒酶活性ΔA值逐漸降低，隨著獲卵數的增加端粒酶活性ΔA值逐漸上升，即端粒酶活性與年齡、促性腺激素量呈負相關，端粒酶活性與獲卵數呈正相關(P<0.05)；低反應組與中反應組和高反應組之間差異均有統計學意義(P<0.01)。隨著優質胚胎率的升高，顆粒細胞端粒酶活性也逐漸升高，二者呈正相關(P<0.01)；胚胎高質量組與低質量組顆粒細胞端粒酶活性差異有統計學意義(P<0.01)。結論體外培養的人卵巢黃素化顆粒細胞存在端粒酶活性的表達。黃素化顆粒細胞端粒酶活性降低與卵巢功能的下降可能有關，顆粒細胞的凋亡可能影響卵母細胞的發育潛能。

體外受精；胚胎移植；卵巢

卵巢顆粒細胞具有高度的增殖與分化潛能，在卵泡發育的不同階段，顆粒細胞增殖速度不同，當卵母細胞發育成熟并接近卵泡壁時，顆粒細胞分裂能力最強[1]，對卵泡的形成和發育及卵母細胞的營養和成熟起重要作用。端粒對于保持染色體穩定性和細胞活性有重要作用。端粒酶能延長縮短的端粒，在保持端粒穩定、基因組完整、細胞長期的活性和潛在的繼續增殖能力等方面有重要作用[2]。本研究通過測定體外受精(invitrofertilization，IVF)中獲取的人卵巢黃素化顆粒細胞端粒酶的活性，探討其與卵巢反應性和胚胎質量的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料：2007年11月—2008年12月在河北醫科大學第二醫院生殖醫學科行IVF治療的不孕癥患者56例，年齡23～37歲，平均(29.57±3.97)歲，月經周期正常，不孕原因為雙側輸卵管梗阻?；A體溫呈雙向型，血清泌乳素水平在正常范圍，受試前3個月內均未服用過激素類藥物。促排卵方案采用常規長周期降調節方案[3]，陰道超聲引導下穿刺取卵，記錄每位患者促性腺激素(gonadotropin,Gn)使用量。分離出卵丘復合物后的卵泡液經患者夫婦同意用于科研用途。根據取卵時卵泡發育數不同進行卵巢反應性分組，卵泡直徑為16mm以上的卵泡數≤4個為卵巢低反應組(簡稱低反應組)8例，卵泡數5～19個為卵巢中反應組(簡稱中反應組)38例，≥20個為卵巢高反應組(簡稱高反應組)10例。1、2級胚定為優質胚，優質胚率=優質胚數/形成卵裂的胚數×100%。優質胚率<60%，為胚胎質量低組(簡稱低質量組)30例，優質胚率≥60%，為胚胎質量高組(簡稱高質量組)26例。

1.2 人黃素化顆粒細胞的分離：分離出卵丘復合物后的卵泡液，經1 000r/min離心10min，棄上清。細胞沉淀物加適量PBS混勻。然后緩慢加入到45%Percoll分離液上層(按1∶1比例)，1 000r/min離心20min。吸取界面處的顆粒細胞層，加入0.25%胰蛋白酶，37℃消化5～10min，加入含10%胎牛血清的1640培養液中止消化，1 000r/min離心10min，棄上清，經胎盤藍染色細胞存活率在85%～90%，將活顆粒細胞濃度調整為2×105/mL的單細胞懸液備用。整個細胞收集過程要盡快完成，避免引起顆粒細胞額外的損傷和死亡。

1.3 人黃素化顆粒細胞的培養及HE染色：采用蓋玻片培養法，將部分人黃素化顆粒細胞單細胞懸液分別置于6孔板中，6孔板中已經提前放置好用0.05%L-多聚賴氨酸涂布無菌蓋玻片，37℃、5%CO2培養箱培養，24h后，細胞貼壁達到80%以上，蒸餾水沖洗，蘇木精染色3min，自來水沖洗，1%鹽酸酒精分化，氨水返藍，自來水沖洗，伊紅染色1min，常規梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡觀察。

1.4 端粒重復序列擴增酶聯免疫吸附分析測定端粒酶活性：按該試劑盒所提供的操作程序進行。每反應體系取2×105個細胞加入100μL裂解液[含Tris-HCl(pH7.5)10mmol/L、MgCl21mmol/L、EGTA1mmol/L、PMSF0.1mmol/L、β-巰基乙醇50mmol/L,0.5%CHAPS、10%甘油]，4℃下裂解1～2h。然后離心(4℃，12 000r/min，15min)取上層水相，此為總mRNA。取5μL細胞提取物，加至PCR反應管中，構建50μL的反應體系(為一種含Tris緩沖液，包含有端粒酶底物、引物、Taq聚合酶、核苷酸，并有生物素標記的P1-TS上游引物和P2下游引物)。引物延伸，25℃ 30min1次；端粒酶滅活，94℃ 5min2次；擴增，變性94℃ 30s、退火，50℃ 30s、延伸，72℃ 90s，共29個循環；最后延伸，72℃ 10min1次。如此反應作用原理是先以端粒酶RNA為模板逆轉錄合成端粒DNA并將端粒重復序列(TTAGGG)加到帶有生物素標記的上游引物末端，再用下游引物與之結合，通過PCR擴增法延伸出產物。取5μLl擴增產物，加入20μL變性試劑，25℃孵育10min，再加入225μL雜交緩沖液，振蕩混勻后取100μL混合物加入已包被微孔板的孔中，37℃,300r/min振蕩2h，棄去雜交液，用緩沖液清洗3次；加入抗-DIG-POD工作液100μL，25℃，30min，再用緩沖液清洗5次；加入TMB底物溶液100μL，20min后再加入100μL終止液終止反應。用酶標儀測定450、690nm的吸光度(absorbance，A)值。端粒酶活性用ΔA=A450-A690表示。

2 結 果

2.1 人黃素化顆粒細胞在體外培養生長情況：分離提純的人黃素化顆粒細胞培養顯示，細胞于24h內貼壁生長良好，倒置顯微鏡下觀察細胞，見細胞主要呈星形或橢圓形生長，細胞有細長的突起，相互連接，細胞核大、圓，胞漿飽滿富含顆粒，HE染色可見細胞核呈藍紫色，胞漿均勻呈淡粉紅色，核仁清晰。

2.2 端粒酶活性的表達與卵巢反應性：高反應組、中反應組端粒酶活性較低反應組高，差異均有統計學意義(P<0.01)，而中反應組與高反應組間差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

GroupsnTelomeraseactivityHighrespond100．405±0．075?Moderaterespond380．355±0．116?Lowrespond80．160±0．043 F14．563 P<0．01

*P<0.01vslow respond group byqtest

2.3 端粒酶活性的表達與胚胎質量：胚胎高質量組端粒酶活性較低質量組高，差異有統計學意義(P<0.01)，見表2。

GroupsnTelomeraseactivityHighquality260．408±0．088Lowquality300．273±0．120t4．753P<0．01

2.4 相關性分析：隨著患者的年齡、使用Gn量的增加，端粒酶活性ΔA值逐漸降低，隨著獲卵數的增加端粒酶活性ΔA值逐漸上升，即端粒酶活性與年齡、Gn量呈負相關(r=-0.493、-0.424，P<0.05)，與獲卵數呈正相關(r=-0.491，P<0.05)。隨著優質胚率的升高，顆粒細胞端粒酶活性也逐漸升高，二者呈正相關(r=-0.697，P<0.01)。

3 討 論

3.1 端粒酶在人卵巢黃素化顆粒細胞的表達：在細胞的每次增殖分裂過程中，各種有害的結合會發生在染色體末端，一旦有害結合造成的損害達到功能基因時，細胞就會進入衰老并死亡。端粒一般存于染色體的末端，其功能不良就會使染色體斷裂。而端粒酶活性對維持端粒長度至關重要，端粒酶活性降低使端粒功能不良，導致遺傳信息進行傳代時的不完整，進而細胞死亡[4]。本研究結果顯示，體外培養的人卵巢黃素化顆粒細胞存在端粒酶活性的表達。黃素化顆粒細胞具有端粒酶活性，反映了此時顆粒細胞的增殖能力，推測黃素化顆粒細胞可能借此使端粒保持一定長度，從而保障其生理功能的正常發揮。

3.2 端粒酶活性與卵巢反應性：隨著女性年齡增長其生育力下降，對評估卵巢功能的方法目前臨床上包括血清基礎卵泡刺激素水平、氯米芬試驗、促性腺激素釋放激素激動劑刺激試驗、超聲監測竇卵泡數等，但都只能間接反映卵巢功能。卵巢功能下降，卵巢內卵泡數目持續性減少，卵巢內主要細胞顆粒細胞功能的減弱可能是較為重要的因素。端粒酶活性的降低可能與顆粒細胞凋亡導致卵泡的閉鎖加劇有關。Yamagata等[5]研究卵泡閉鎖與端粒酶活性之間的關系，發現未成年大鼠皮下注射馬絨毛膜促性腺激素后第2天顆粒細胞端粒酶活性明顯升高，第4～5天時當較大的卵泡發生閉鎖后，顆粒細胞端粒酶活性顯著下降；而給予前列腺素以阻止卵泡閉鎖時，顆粒細胞端粒酶活性未見明顯降低。提示端粒酶活性在卵泡的生長發育過程中可能起到重要的作用，端粒酶活性缺乏可能導致卵泡的閉鎖。本研究結果顯示，黃素化顆粒細胞端粒酶活性與年齡、Gn量呈負相關，與獲卵數呈正相關。提示端粒酶活性降低與卵巢功能的下降有關，端粒酶可能對維持卵巢功能起重要作用。隨著端粒酶檢測方法的定量化及敏感性、特異性的不斷提高，以及通過直接檢測不同年齡卵巢端粒長度，端粒、端粒酶可望成為評價卵巢功能的一項直接而敏感的指標。

3.3 端粒酶活性與胚胎質量：卵母細胞周圍的顆粒細胞層被稱為卵丘顆粒細胞，卵母細胞與卵丘顆粒細胞之間存在廣泛的復雜連接機制，包括細胞間的縫隙連接等，對調節卵母細胞發育起著非常重要的作用[6]。卵丘顆粒細胞向卵母細胞運送其所需要的營養物質，同時激素、生長因子等多種物質也通過顆粒細胞對卵母細胞發揮作用，此外某些特定生長因子、蛋白質還可以通過卵丘顆粒細胞貯存和釋放，這些生長因子、蛋白質在卵母細胞成熟及卵裂球發育過程中按一定順序表達或選擇性地彌散來發揮調節作用。另外，卵母細胞還分泌一些具有旁分泌作用的重要因子，這些因子能夠促進顆粒細胞增殖、分化，并調節顆粒細胞的功能，卵母細胞與顆粒細胞之間的相互協調、相互作用，共同調節卵泡的正常發育[7]。卵母細胞的成熟、受精及后續相應胚胎的質量與其周圍的顆粒細胞的凋亡之間存在著密切相關性[8]。H?st等[9]研究表明，顆粒細胞的凋亡與卵母細胞核的成熟、受精有關。本研究結果顯示，優質胚率與顆粒細胞端粒酶活性有明顯的相關性。顆粒細胞與卵母細胞之間的縫隙連接對卵母細胞起著重要的作用，細胞凋亡會引起組織細胞的退化、萎縮及功能低下。在卵母細胞成熟前，其處于開放狀態，顆粒細胞向卵母細胞傳遞凋亡信息，大量分子物質從而進入卵母細胞。而當凋亡信息過強時，也就是顆粒細胞異常過強的凋亡可能影響卵母細胞質量，進而影響卵母細胞的發育潛能，影響胚胎的質量。顆粒細胞凋亡率低的卵母細胞獲得的胚胎移植后妊娠率高于凋亡率高者[10]。

綜上所述，卵巢顆粒細胞端粒酶表達與促排卵時卵巢反應性及胚胎質量有關，其可能通過調節顆粒細胞的增殖起作用，其表達水平可能作為一個反應卵母細胞及胚胎質量的標志物，從而對超排卵起指導作用。

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(本文編輯：趙麗潔)

RELATIONSHIPOFTELOMETASEACTIVITYOFHUMANLUTEINEDGRANULOSACELLSWITHOVARIANRESPONSEANDEMBRYOQUALITY

ZHAOZhiming,CUINa,HAOGuimin,XUSuxin
(CenterofReproductiveMedicine,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China)

ObjectiveToexploretherelationshipoftelomeraseactivityofhumanluteinedgranulosacells(GCs)withovarianresponseandembryoquality.MethodsFity-sixcasesreceivingIVF-ETwereusedtocollectthedataofGCs.TheexperimentwascarriedoutthroughthefollowingproceduresluteinedGCswereisolatedfromfolliclefluidandwerecultured24hourssoon;testsofthetelomeraseactivityofGCswithTRAP-ELISA.Comparisonsofage,numberofampulesofgonadotropin(Gn)administered,numberofretrievedoocytes,rateofhighqualityembryowithtelomeraseactivityweremadeindifferentovarianresponseandembryoqualitygroups.ResultsIsolatedandpurifiedGCswereculturedandadherencedwellin24hours.TherewerenegativecorrelationbetweentelomeraseactivityofGCswithage,numberofampulesofGnadministeredandpositivecorrelationwithnumberofretrievedoocytes(P<0.05).LowresponsegrouphadlowertelomeraseactivityinGCscomparedtomediumandhighresponsegroups(P<0.01).TherewerepositivecorrelationbetweentelomeraseactivityofGCswithratioofhighembryoquality(P<0.01).TherewassignificantdifferenceoftelomeraseactivityofGCsindifferentembryoqualitygroups(P<0.01).ConclusionTelomeraseactivitycouldbetestedinhumanluteinizedGCsafterinvitroculture.ItmaysuggestthattelomeraseactivitydecreasedwiththedeclineinovarianfunctionandtheapoptosisofGCsmaydirectlyaffectoocytedevelopmentalpotential.

fertilizationinvitro;embryotransfer;ovary

2014-02-22；

2014-05-29

河北省科技廳科技支撐計劃(10276105D-88)；河北醫科大學第二醫院基金項目(2h1200728)

趙志明(1973-)，女，河北饒陽人，河北醫科大學第醫院副主任醫師、副教授，醫學博士，從事人類輔助生殖技術研究。

R321-33

A

1007-3205(2014)06-0621-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.06.001