人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞端粒酶活性與卵巢反應(yīng)性及胚胎質(zhì)量的關(guān)系

趙志明，崔 娜，郝桂敏，徐素欣(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，河北 石家莊 050000)

·論著·

人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞端粒酶活性與卵巢反應(yīng)性及胚胎質(zhì)量的關(guān)系

趙志明，崔 娜，郝桂敏，徐素欣
(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，河北 石家莊 050000)

目的探討體外受精-胚胎移植中人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞端粒酶的活性與相應(yīng)卵巢反應(yīng)性和胚胎質(zhì)量的關(guān)系。方法收集56例行體外受精-胚胎移植患者卵泡液中的黃素化顆粒細(xì)胞，并進(jìn)行體外培養(yǎng)；根據(jù)卵泡數(shù)不同分為低反應(yīng)組、中反應(yīng)組和高反應(yīng)組；又根據(jù)優(yōu)質(zhì)胚胎率不同分為低質(zhì)量組和高質(zhì)量組。端粒重復(fù)序列擴(kuò)增酶聯(lián)免疫吸附分析法測(cè)定顆粒細(xì)胞端粒酶活性，并比較低反應(yīng)組、中反應(yīng)組與高反應(yīng)組以及低質(zhì)量組與高質(zhì)量組顆粒細(xì)胞端粒酶的活性。結(jié)果分離提純的人黃素化顆粒細(xì)胞于24h內(nèi)貼壁生長(zhǎng)良好。隨著患者的年齡、使用促性腺激素量的增加，端粒酶活性ΔA值逐漸降低，隨著獲卵數(shù)的增加端粒酶活性ΔA值逐漸上升，即端粒酶活性與年齡、促性腺激素量呈負(fù)相關(guān)，端粒酶活性與獲卵數(shù)呈正相關(guān)(P<0.05)；低反應(yīng)組與中反應(yīng)組和高反應(yīng)組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。隨著優(yōu)質(zhì)胚胎率的升高，顆粒細(xì)胞端粒酶活性也逐漸升高，二者呈正相關(guān)(P<0.01)；胚胎高質(zhì)量組與低質(zhì)量組顆粒細(xì)胞端粒酶活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論體外培養(yǎng)的人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞存在端粒酶活性的表達(dá)。黃素化顆粒細(xì)胞端粒酶活性降低與卵巢功能的下降可能有關(guān)，顆粒細(xì)胞的凋亡可能影響卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能。

體外受精；胚胎移植；卵巢

卵巢顆粒細(xì)胞具有高度的增殖與分化潛能，在卵泡發(fā)育的不同階段，顆粒細(xì)胞增殖速度不同，當(dāng)卵母細(xì)胞發(fā)育成熟并接近卵泡壁時(shí)，顆粒細(xì)胞分裂能力最強(qiáng)[1]，對(duì)卵泡的形成和發(fā)育及卵母細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)和成熟起重要作用。端粒對(duì)于保持染色體穩(wěn)定性和細(xì)胞活性有重要作用。端粒酶能延長(zhǎng)縮短的端粒，在保持端粒穩(wěn)定、基因組完整、細(xì)胞長(zhǎng)期的活性和潛在的繼續(xù)增殖能力等方面有重要作用[2]。本研究通過(guò)測(cè)定體外受精(invitrofertilization，IVF)中獲取的人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞端粒酶的活性，探討其與卵巢反應(yīng)性和胚胎質(zhì)量的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料：2007年11月—2008年12月在河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科行IVF治療的不孕癥患者56例，年齡23～37歲，平均(29.57±3.97)歲，月經(jīng)周期正常，不孕原因?yàn)殡p側(cè)輸卵管梗阻。基礎(chǔ)體溫呈雙向型，血清泌乳素水平在正常范圍，受試前3個(gè)月內(nèi)均未服用過(guò)激素類藥物。促排卵方案采用常規(guī)長(zhǎng)周期降調(diào)節(jié)方案[3]，陰道超聲引導(dǎo)下穿刺取卵，記錄每位患者促性腺激素(gonadotropin,Gn)使用量。分離出卵丘復(fù)合物后的卵泡液經(jīng)患者夫婦同意用于科研用途。根據(jù)取卵時(shí)卵泡發(fā)育數(shù)不同進(jìn)行卵巢反應(yīng)性分組，卵泡直徑為16mm以上的卵泡數(shù)≤4個(gè)為卵巢低反應(yīng)組(簡(jiǎn)稱低反應(yīng)組)8例，卵泡數(shù)5～19個(gè)為卵巢中反應(yīng)組(簡(jiǎn)稱中反應(yīng)組)38例，≥20個(gè)為卵巢高反應(yīng)組(簡(jiǎn)稱高反應(yīng)組)10例。1、2級(jí)胚定為優(yōu)質(zhì)胚，優(yōu)質(zhì)胚率=優(yōu)質(zhì)胚數(shù)/形成卵裂的胚數(shù)×100%。優(yōu)質(zhì)胚率<60%，為胚胎質(zhì)量低組(簡(jiǎn)稱低質(zhì)量組)30例，優(yōu)質(zhì)胚率≥60%，為胚胎質(zhì)量高組(簡(jiǎn)稱高質(zhì)量組)26例。

1.2 人黃素化顆粒細(xì)胞的分離：分離出卵丘復(fù)合物后的卵泡液，經(jīng)1 000r/min離心10min，棄上清。細(xì)胞沉淀物加適量PBS混勻。然后緩慢加入到45%Percoll分離液上層(按1∶1比例)，1 000r/min離心20min。吸取界面處的顆粒細(xì)胞層，加入0.25%胰蛋白酶，37℃消化5～10min，加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中止消化，1 000r/min離心10min，棄上清，經(jīng)胎盤藍(lán)染色細(xì)胞存活率在85%～90%，將活顆粒細(xì)胞濃度調(diào)整為2×105/mL的單細(xì)胞懸液備用。整個(gè)細(xì)胞收集過(guò)程要盡快完成，避免引起顆粒細(xì)胞額外的損傷和死亡。

1.3 人黃素化顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)及HE染色：采用蓋玻片培養(yǎng)法，將部分人黃素化顆粒細(xì)胞單細(xì)胞懸液分別置于6孔板中，6孔板中已經(jīng)提前放置好用0.05%L-多聚賴氨酸涂布無(wú)菌蓋玻片，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24h后，細(xì)胞貼壁達(dá)到80%以上，蒸餾水沖洗，蘇木精染色3min，自來(lái)水沖洗，1%鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)，自來(lái)水沖洗，伊紅染色1min，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡觀察。

1.4 端粒重復(fù)序列擴(kuò)增酶聯(lián)免疫吸附分析測(cè)定端粒酶活性：按該試劑盒所提供的操作程序進(jìn)行。每反應(yīng)體系取2×105個(gè)細(xì)胞加入100μL裂解液[含Tris-HCl(pH7.5)10mmol/L、MgCl21mmol/L、EGTA1mmol/L、PMSF0.1mmol/L、β-巰基乙醇50mmol/L,0.5%CHAPS、10%甘油]，4℃下裂解1～2h。然后離心(4℃，12 000r/min，15min)取上層水相，此為總mRNA。取5μL細(xì)胞提取物，加至PCR反應(yīng)管中，構(gòu)建50μL的反應(yīng)體系(為一種含Tris緩沖液，包含有端粒酶底物、引物、Taq聚合酶、核苷酸，并有生物素標(biāo)記的P1-TS上游引物和P2下游引物)。引物延伸，25℃ 30min1次；端粒酶滅活，94℃ 5min2次；擴(kuò)增，變性94℃ 30s、退火，50℃ 30s、延伸，72℃ 90s，共29個(gè)循環(huán)；最后延伸，72℃ 10min1次。如此反應(yīng)作用原理是先以端粒酶RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒DNA并將端粒重復(fù)序列(TTAGGG)加到帶有生物素標(biāo)記的上游引物末端，再用下游引物與之結(jié)合，通過(guò)PCR擴(kuò)增法延伸出產(chǎn)物。取5μLl擴(kuò)增產(chǎn)物，加入20μL變性試劑，25℃孵育10min，再加入225μL雜交緩沖液，振蕩混勻后取100μL混合物加入已包被微孔板的孔中，37℃,300r/min振蕩2h，棄去雜交液，用緩沖液清洗3次；加入抗-DIG-POD工作液100μL，25℃，30min，再用緩沖液清洗5次；加入TMB底物溶液100μL，20min后再加入100μL終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測(cè)定450、690nm的吸光度(absorbance，A)值。端粒酶活性用ΔA=A450-A690表示。

2 結(jié) 果

2.1 人黃素化顆粒細(xì)胞在體外培養(yǎng)生長(zhǎng)情況：分離提純的人黃素化顆粒細(xì)胞培養(yǎng)顯示，細(xì)胞于24h內(nèi)貼壁生長(zhǎng)良好，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，見細(xì)胞主要呈星形或橢圓形生長(zhǎng)，細(xì)胞有細(xì)長(zhǎng)的突起，相互連接，細(xì)胞核大、圓，胞漿飽滿富含顆粒，HE染色可見細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，胞漿均勻呈淡粉紅色，核仁清晰。

2.2 端粒酶活性的表達(dá)與卵巢反應(yīng)性：高反應(yīng)組、中反應(yīng)組端粒酶活性較低反應(yīng)組高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而中反應(yīng)組與高反應(yīng)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

GroupsnTelomeraseactivityHighrespond100．405±0．075?Moderaterespond380．355±0．116?Lowrespond80．160±0．043 F14．563 P<0．01

*P<0.01vslow respond group byqtest

2.3 端粒酶活性的表達(dá)與胚胎質(zhì)量：胚胎高質(zhì)量組端粒酶活性較低質(zhì)量組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

GroupsnTelomeraseactivityHighquality260．408±0．088Lowquality300．273±0．120t4．753P<0．01

2.4 相關(guān)性分析：隨著患者的年齡、使用Gn量的增加，端粒酶活性ΔA值逐漸降低，隨著獲卵數(shù)的增加端粒酶活性ΔA值逐漸上升，即端粒酶活性與年齡、Gn量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.493、-0.424，P<0.05)，與獲卵數(shù)呈正相關(guān)(r=-0.491，P<0.05)。隨著優(yōu)質(zhì)胚率的升高，顆粒細(xì)胞端粒酶活性也逐漸升高，二者呈正相關(guān)(r=-0.697，P<0.01)。

3 討 論

3.1 端粒酶在人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞的表達(dá)：在細(xì)胞的每次增殖分裂過(guò)程中，各種有害的結(jié)合會(huì)發(fā)生在染色體末端，一旦有害結(jié)合造成的損害達(dá)到功能基因時(shí)，細(xì)胞就會(huì)進(jìn)入衰老并死亡。端粒一般存于染色體的末端，其功能不良就會(huì)使染色體斷裂。而端粒酶活性對(duì)維持端粒長(zhǎng)度至關(guān)重要，端粒酶活性降低使端粒功能不良，導(dǎo)致遺傳信息進(jìn)行傳代時(shí)的不完整，進(jìn)而細(xì)胞死亡[4]。本研究結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)的人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞存在端粒酶活性的表達(dá)。黃素化顆粒細(xì)胞具有端粒酶活性，反映了此時(shí)顆粒細(xì)胞的增殖能力，推測(cè)黃素化顆粒細(xì)胞可能借此使端粒保持一定長(zhǎng)度，從而保障其生理功能的正常發(fā)揮。

3.2 端粒酶活性與卵巢反應(yīng)性：隨著女性年齡增長(zhǎng)其生育力下降，對(duì)評(píng)估卵巢功能的方法目前臨床上包括血清基礎(chǔ)卵泡刺激素水平、氯米芬試驗(yàn)、促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑刺激試驗(yàn)、超聲監(jiān)測(cè)竇卵泡數(shù)等，但都只能間接反映卵巢功能。卵巢功能下降，卵巢內(nèi)卵泡數(shù)目持續(xù)性減少，卵巢內(nèi)主要細(xì)胞顆粒細(xì)胞功能的減弱可能是較為重要的因素。端粒酶活性的降低可能與顆粒細(xì)胞凋亡導(dǎo)致卵泡的閉鎖加劇有關(guān)。Yamagata等[5]研究卵泡閉鎖與端粒酶活性之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)未成年大鼠皮下注射馬絨毛膜促性腺激素后第2天顆粒細(xì)胞端粒酶活性明顯升高，第4～5天時(shí)當(dāng)較大的卵泡發(fā)生閉鎖后，顆粒細(xì)胞端粒酶活性顯著下降；而給予前列腺素以阻止卵泡閉鎖時(shí)，顆粒細(xì)胞端粒酶活性未見明顯降低。提示端粒酶活性在卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中可能起到重要的作用，端粒酶活性缺乏可能導(dǎo)致卵泡的閉鎖。本研究結(jié)果顯示，黃素化顆粒細(xì)胞端粒酶活性與年齡、Gn量呈負(fù)相關(guān)，與獲卵數(shù)呈正相關(guān)。提示端粒酶活性降低與卵巢功能的下降有關(guān)，端粒酶可能對(duì)維持卵巢功能起重要作用。隨著端粒酶檢測(cè)方法的定量化及敏感性、特異性的不斷提高，以及通過(guò)直接檢測(cè)不同年齡卵巢端粒長(zhǎng)度，端粒、端粒酶可望成為評(píng)價(jià)卵巢功能的一項(xiàng)直接而敏感的指標(biāo)。

3.3 端粒酶活性與胚胎質(zhì)量：卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞層被稱為卵丘顆粒細(xì)胞，卵母細(xì)胞與卵丘顆粒細(xì)胞之間存在廣泛的復(fù)雜連接機(jī)制，包括細(xì)胞間的縫隙連接等，對(duì)調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞發(fā)育起著非常重要的作用[6]。卵丘顆粒細(xì)胞向卵母細(xì)胞運(yùn)送其所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)激素、生長(zhǎng)因子等多種物質(zhì)也通過(guò)顆粒細(xì)胞對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)揮作用，此外某些特定生長(zhǎng)因子、蛋白質(zhì)還可以通過(guò)卵丘顆粒細(xì)胞貯存和釋放，這些生長(zhǎng)因子、蛋白質(zhì)在卵母細(xì)胞成熟及卵裂球發(fā)育過(guò)程中按一定順序表達(dá)或選擇性地彌散來(lái)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。另外，卵母細(xì)胞還分泌一些具有旁分泌作用的重要因子，這些因子能夠促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖、分化，并調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的功能，卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞之間的相互協(xié)調(diào)、相互作用，共同調(diào)節(jié)卵泡的正常發(fā)育[7]。卵母細(xì)胞的成熟、受精及后續(xù)相應(yīng)胚胎的質(zhì)量與其周圍的顆粒細(xì)胞的凋亡之間存在著密切相關(guān)性[8]。H?st等[9]研究表明，顆粒細(xì)胞的凋亡與卵母細(xì)胞核的成熟、受精有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，優(yōu)質(zhì)胚率與顆粒細(xì)胞端粒酶活性有明顯的相關(guān)性。顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間的縫隙連接對(duì)卵母細(xì)胞起著重要的作用，細(xì)胞凋亡會(huì)引起組織細(xì)胞的退化、萎縮及功能低下。在卵母細(xì)胞成熟前，其處于開放狀態(tài)，顆粒細(xì)胞向卵母細(xì)胞傳遞凋亡信息，大量分子物質(zhì)從而進(jìn)入卵母細(xì)胞。而當(dāng)?shù)蛲鲂畔⑦^(guò)強(qiáng)時(shí)，也就是顆粒細(xì)胞異常過(guò)強(qiáng)的凋亡可能影響卵母細(xì)胞質(zhì)量，進(jìn)而影響卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能，影響胚胎的質(zhì)量。顆粒細(xì)胞凋亡率低的卵母細(xì)胞獲得的胚胎移植后妊娠率高于凋亡率高者[10]。

綜上所述，卵巢顆粒細(xì)胞端粒酶表達(dá)與促排卵時(shí)卵巢反應(yīng)性及胚胎質(zhì)量有關(guān)，其可能通過(guò)調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的增殖起作用，其表達(dá)水平可能作為一個(gè)反應(yīng)卵母細(xì)胞及胚胎質(zhì)量的標(biāo)志物，從而對(duì)超排卵起指導(dǎo)作用。

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(本文編輯：趙麗潔)

RELATIONSHIPOFTELOMETASEACTIVITYOFHUMANLUTEINEDGRANULOSACELLSWITHOVARIANRESPONSEANDEMBRYOQUALITY

ZHAOZhiming,CUINa,HAOGuimin,XUSuxin
(CenterofReproductiveMedicine,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China)

ObjectiveToexploretherelationshipoftelomeraseactivityofhumanluteinedgranulosacells(GCs)withovarianresponseandembryoquality.MethodsFity-sixcasesreceivingIVF-ETwereusedtocollectthedataofGCs.TheexperimentwascarriedoutthroughthefollowingproceduresluteinedGCswereisolatedfromfolliclefluidandwerecultured24hourssoon;testsofthetelomeraseactivityofGCswithTRAP-ELISA.Comparisonsofage,numberofampulesofgonadotropin(Gn)administered,numberofretrievedoocytes,rateofhighqualityembryowithtelomeraseactivityweremadeindifferentovarianresponseandembryoqualitygroups.ResultsIsolatedandpurifiedGCswereculturedandadherencedwellin24hours.TherewerenegativecorrelationbetweentelomeraseactivityofGCswithage,numberofampulesofGnadministeredandpositivecorrelationwithnumberofretrievedoocytes(P<0.05).LowresponsegrouphadlowertelomeraseactivityinGCscomparedtomediumandhighresponsegroups(P<0.01).TherewerepositivecorrelationbetweentelomeraseactivityofGCswithratioofhighembryoquality(P<0.01).TherewassignificantdifferenceoftelomeraseactivityofGCsindifferentembryoqualitygroups(P<0.01).ConclusionTelomeraseactivitycouldbetestedinhumanluteinizedGCsafterinvitroculture.ItmaysuggestthattelomeraseactivitydecreasedwiththedeclineinovarianfunctionandtheapoptosisofGCsmaydirectlyaffectoocytedevelopmentalpotential.

fertilizationinvitro;embryotransfer;ovary

2014-02-22；

2014-05-29

河北省科技廳科技支撐計(jì)劃(10276105D-88)；河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院基金項(xiàng)目(2h1200728)

趙志明(1973-)，女，河北饒陽(yáng)人，河北醫(yī)科大學(xué)第醫(yī)院副主任醫(yī)師、副教授，醫(yī)學(xué)博士，從事人類輔助生殖技術(shù)研究。

R321-33

A

1007-3205(2014)06-0621-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.06.001