運輸對圈養大熊貓應激影響初探

唐 丹 楊 波 張志忠，3 王 一 朱 濤 吳代福林冰森 周季秋 瞿桂麗 李登翯 黃 炎*

(1.中國大熊貓保護研究中心，都江堰，611830；2.大熊貓國家公園珍稀動物保護生物學國家林業和草原局重點實驗室，都江堰，611830；3.國家林業和草原局野生動植物保護司，北京，100714；4.沈陽森林動物園管理有限公司，沈陽，110164)

近年來動物應激成了野生動物保護的研究重點，是動物健康和福利的重要指標。應激過大會對動物造成免疫系統、生殖能力以及生長發育等方面的影響[1]。因此，針對不同的刺激源，研究動物對其的應激反應大小，是動物保護工作重要的一環。運輸應激作為其中一種應激因素，在圈養野生動物中發生頻次較多，但卻缺乏系統而全面的研究[2]，主要集中在亞洲象(Elephasmaximus)[3-4]，虎(Pantheratigris)[5]、野馬(Equuscaballus)、斑鬣狗(Crocutacrocuta)[6]等的研究上。

大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)作為中國特有的重點保護物種，對其應激源的研究主要集中在熱源[7-8]，游客干擾[9]，麻醉[8]，噪音[10-11]、光照[12]、環境[13]等方面，并未見運輸應激相關的研究，而實際的飼養管理工作中，如繁殖配對，大熊貓旅居海外，放歸轉運等，都需要運輸大熊貓。因此，研究長途運輸對于大熊貓應激反應具有實際意義。

1 研究對象

研究對象為19只大熊貓(16♀，3♂)，運輸工具為汽車且運輸時間均在2 h以上，裝載籠箱長126 cm，寬65 cm，高74 cm。根據年齡將研究對象劃分為2組：Ⅰ：0—10歲，Ⅱ：10—20歲。實驗期間健康狀況良好。

2 研究方法

2.1 樣品采集及預處理

從運輸前7 d開始逐日采集每一只大熊貓個體的糞便樣品，持續至運輸后第10天，共計18 d。運輸當天的糞便樣品全部采集，運輸前后的樣品每日采集1次，采樣時間集中在9：00—11：00，為避免樣品污染，使用PE手套采集樣品后立即放入樣品密封袋，并詳細記錄名稱、日期、時間和地點等信息。然后按個體分別放入-20℃冰箱保存。樣品采集完畢后，用真空冷凍干燥機(ThermoMODULYOD-230)干燥糞便至恒重，揉碎后取粉末部分保存于-80℃冰箱中。

表1 研究對象的基本信息Tab.1 Basic information of the giant pandas in the study

2.2 皮質醇激素的提取與測定

2.2.1 皮質醇的提取

稱取0.09—0.1 g糞便粉末放入10 mL 離心管中，加入5 mL 90%乙醇，震蕩20 min，然后1 500 rpm離心20 min，取上清液并移入10 mL 試管，再加入5 mL 90%乙醇，重復震蕩離心取上清液，將收集到的上清液置于30℃水浴中待乙醇完全揮發，加入3 mL無水乙醇，再次完全揮發后加入1 mL溶解液，充分震蕩，再移入500 μL 離心管中，保存于-20℃ 的冰箱中待檢測。

2.2.2 皮質醇的測定

采用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定待測樣品中皮質醇含量。大致步驟為：將二抗(Sigma R2004-5 Anti-Rabbit IgG)包被至酶標板，配制標準品和稀釋樣品，并用洗液清洗過的包被酶標板，依次加入標準品、樣品、酶免反應酶HRP以及抗體2，孵育90 min后取出洗板，加酶免反應底物TMB，顯示反應30 min后，加入H2SO4終止反應，最后在酶標儀(BioTek Elx800)上進行讀數。

2.2.3 數據分析

激素濃度表示為Mean±SE。經正態分布和方差齊性檢驗，激素濃度不遵循正態分布與方差齊性，故采用非參數檢驗法(Kruskai-Wallis test)。

3 結果

3.1 運輸對大熊貓糞便皮質醇水平的影響

以運輸前7 d(-7—-1 d)皮質醇濃度作為大熊貓體內皮質醇正常水平值(278.68±21.92)ng/g，與運輸后皮質醇濃度做比較，統計結果表明，運輸當天皮質醇濃度開始顯著升高(667.64±114.57)ng/g，P=0.006，運輸后第1天皮質醇濃度有所下降，第2天再次上升至(621.72±206.92)ng/g，P=0.006。第3天皮質醇濃度恢復至運輸前水平(184.42±32.22)ng/g，P=0.533。(圖1)。

圖1 轉運前后各時間段大熊貓個體皮質醇濃度變化Fig.1 Fecal cortisol concentrations of giant pandas for each time for block

從個體情況看，運輸個體F13在運輸后第一天皮質醇水平達到峰值(圖3)，而運輸個體F12則在運輸后第二天達到峰值(圖2)。

圖2 個體F12轉運前后各時間段大熊貓個體皮質醇濃度變化Fig.2 Fecal cortisol concentrations of F12 for each time for block

圖3 個體F13轉運前后各時間段大熊貓個體皮質醇濃度變化Fig.3 Fecal cortisol concentrations of F13 for each time for block

3.2 運輸對不同年齡大熊貓糞便皮質醇的影響

比較2個年齡組間皮質醇水平變化情況，從圖4中可以看出，第Ⅰ組(0—10歲)在轉運當天到第2天皮質醇濃度明顯升高(P<0.05)，而第Ⅱ組(10—20歲)運輸后皮質醇濃度沒有出現明顯的升高(P>0.05)。

圖4 轉運前后各年齡組大熊貓個體皮質醇濃度變化Fig.4 Fecal cortisol concentrations of giant pandas between different age for each time for block

4 討論

已有許多研究揭示了運輸刺激對野生動物應激狀態的影響。無運輸經驗的老虎在長途運輸后的3—6 d皮質醇水平達到最高，約為運輸前的4倍[5]。雄性斑鬣狗運輸后的第3天皮質醇達到峰值，第4天恢復至正常水平[6]。雄性亞洲象經過近24 h的運輸，皮質醇激素在2 d后達到峰值，增幅高達389%[3]。

不同物種運輸應激情況有所不同，同一物種不同個體運輸應激情況也有不同。在我們得到的數據中，每個大熊貓個體皮質醇水平變化情況也有不同，如運輸個體F13在轉運后第1天皮質醇水平增高至峰值2 260 ng/g(圖3)，而運輸個體F12在運輸后的第2天皮質醇水平才達到峰值13 340 ng/g(圖2)。而皮質醇到達峰值的時間不同，是由于我們檢測的為糞便中的激素濃度，激素分泌后需隨食物從消化道中排出，而不同動物個體腸道蠕動時間不同，導致激素峰值時間的不同。非洲象(Loxodontaafricana)的研究表明，一只亞成年非洲象在注射完促腎上腺皮質激素后，20—25 h后即可檢測到糞便中皮質醇激素的峰值[14]，而一只老年非洲象在注射完促腎上腺皮質激素后，46 h后才能檢測出糞便中的皮質醇激素峰值[15]。而理論上糞便中皮質醇濃度的變化會有一定延遲性，但我們檢測發現運輸當天皮質醇濃度便開始迅速升高，可能是由于運輸當天糞便樣品較多，多數樣品采集時間跨度超過10 h，應激性強的個體在運輸當天中后期激素就已升高。另外個別運輸個體在運輸前(工作人員準備轉運籠等準備工作時)已受到驚擾，表現出一定應激性。

當考慮年齡因素時，第Ⅰ組(0—10歲)在運輸后表現出了明顯的應激性，而第Ⅱ組(10—20歲)運輸后皮質醇濃度沒有顯著性的升高。我們分析這是由于第Ⅰ組的個體年紀較小且多數為首次運輸，沒有運輸經驗，對運輸刺激較敏感，應激反應明顯。而第Ⅱ組15歲以上的大齡熊貓較多，且它們中多數已有豐富的運輸經驗，運輸不能造成明顯的刺激作用。有研究表明動物有無運輸經驗會直接影響應激反應的大小[16]且動物通常對陌生的刺激源表現出更大的應激反應[17]。由于此次實驗個體多為雌性大熊貓，無法體現性別因素對運輸應激的影響。

盡管機體的應激程度分為3個不同的階段[18]，內分泌活動的變化為第一個階段，但運輸后大熊貓皮質醇激素的顯著升高足以說明運輸激發了大熊貓體內應激機能的啟動，這為以后深層次的大熊貓應激研究打下基礎，同時為大熊貓的圈養保護工作提供了理論依據，在一定程度上指導實際的保護研究工作，比如，在每年的大熊貓繁殖季節，由于發情期間大熊貓身體狀況的特殊性，應盡量減少對發情期大熊貓的運輸，如特殊原因需要運輸，最好提前一周進行運輸，減少運輸應激對大熊貓繁殖造成影響。在大熊貓野化放歸研究中，為了避免大熊貓因為運輸產生更嚴重的應激反應，也要減少運輸，運輸后保持安靜等方法，保證大熊貓良好的身體狀況，提高大熊貓放歸后的存活率。