慢性間歇低氧誘導(dǎo)小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的實(shí)驗(yàn)研究

琚靜美 陳 銳 王 婧 明 紅 萬宗仁 劉春風(fēng)

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea hypopnea syndrome, OSAHS)由于睡眠中反復(fù)發(fā)生上氣道部分或完全阻塞而表現(xiàn)為夜間間歇低氧和睡眠結(jié)構(gòu)紊亂，其最重要的一個(gè)病理生理特點(diǎn)是頻繁發(fā)生的夜間低氧和再氧合，這也是引起認(rèn)知功能障礙的最為關(guān)注的原因[1-3]。目前的研究認(rèn)為，海馬、前額葉皮層是公認(rèn)的與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的腦區(qū)。學(xué)習(xí)記憶的中樞機(jī)制是突觸傳遞的長時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation, LTP)[4]，其中，與Ca2+通道藕聯(lián)的N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor, NMDAR)是鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中的關(guān)鍵分子，參與了神經(jīng)突觸可塑性和LTP的形成,與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)[5-6]。Caspase 家族的成員在凋亡的信號(hào)傳遞中具有重要的調(diào)控和效應(yīng)作用[7]，Caspase-3 基因的異常表達(dá)和活化水平在再灌注損傷模型中，是啟動(dòng)受損區(qū)神經(jīng)元凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[8]。本研究通過建立小鼠慢性間歇低氧(chronic intermittent hypoxia, CIH) 模型，觀察小鼠隨著低氧時(shí)間延長，其空間學(xué)習(xí)記憶能力的變化，同時(shí)觀察CIH對(duì)NMDAR亞單位1(NR1)表達(dá)的影響以及海馬神經(jīng)細(xì)胞caspase-3表達(dá)的情況，以探討CIH對(duì)認(rèn)知功能損傷的分子機(jī)制。

材料與方法

一、 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔級(jí)ICR雄性幼鼠60只(3～4周齡)，體重15～20 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，所有的小鼠均喂以同樣的干飼料，飲用普通水，室溫控制在20±2 ℃，相對(duì)濕度50%～70%，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，使其適應(yīng)新環(huán)境。

二、實(shí)驗(yàn)儀器及主要試劑

間歇低氧裝置是本實(shí)驗(yàn)組與天津合普工貿(mào)有限公司共同設(shè)計(jì)，由有機(jī)玻璃低氧艙(規(guī)格為r=20 cm，h=15 cm)、電腦控氧儀、氧濃度探頭(Wismar公司，德國)壓縮空氣機(jī)、氮?dú)庠础怏w傳輸管道等部分組成。Morris圓形水迷宮及視頻分析軟件(上海吉量科技有限公司)；Leica激光共聚焦掃描顯微鏡及分析系統(tǒng)(德國Leica Co. Ltd.)。β-肌動(dòng)蛋白、NMDAR1一抗、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購自Abcam 公司，Caspase-3克隆抗體購自Santa Cruz公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的驢抗羊二抗、DAPI購自碧云天生物科技研究所。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及間歇低氧模型建立：60只ICR小鼠分為常氧對(duì)照組(UC)30只和慢性間歇性缺氧組(CIH) 30只，CIH組根據(jù)低氧造模時(shí)間再分為間歇低氧3 d(A組)、1周(B組)、2周(C組)、4周(E組)、6周(F組)組，及造模結(jié)束后常氧飼養(yǎng)1月的10周組(G組)，每組5只，共6組，同期設(shè)6組對(duì)照組。CIH組小鼠每天8 h飼養(yǎng)于低氧艙內(nèi)(8∶00AM- 4∶00PM)，向艙內(nèi)循環(huán)通入氮?dú)夂蛪嚎s空氣各30 s，以60 s為一個(gè)循環(huán)，使每一循環(huán)艙內(nèi)的最低氧濃度達(dá)到6%～8%，然后再逐漸恢復(fù)到20%～21%。UC組通入同樣流速的壓縮空氣，該實(shí)驗(yàn)周期為6周。CIH組在造模早期，有3只小鼠發(fā)生死亡，予以剔除，并分別在兩組各補(bǔ)充5只小鼠。

2. Morris水迷宮行為學(xué)檢測(cè)：定位航行實(shí)驗(yàn)：造模前小鼠先進(jìn)行Morris水迷宮行為學(xué)測(cè)定，第1天開始訓(xùn)練2次，隨后每天訓(xùn)練4次，歷時(shí)5 d。每次小鼠隨機(jī)從四個(gè)不同象限面向池壁放入水中，觀察并記錄小鼠尋找并爬上平臺(tái)的路線圖、所需時(shí)間(逃避潛伏期) 及各象限的游泳距離和時(shí)間，取四個(gè)象限平均值作為當(dāng)日成績(jī)。如120 s仍未找到平臺(tái)，由操作者將小鼠引上站臺(tái)休息，并將逃避潛伏期記為120 s。記錄第5天成績(jī)，作為間歇低氧造模前成績(jī)，并在低氧3 d、1周、2周及6周造模結(jié)束再次訓(xùn)練后分別對(duì)這兩組進(jìn)行檢測(cè)。空間探索實(shí)驗(yàn)：在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)6周定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后次日，將平臺(tái)撤除，任意一點(diǎn)為入水點(diǎn)，記錄大鼠在120 s內(nèi)穿過原平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)和在原平臺(tái)象限內(nèi)游泳時(shí)間占整個(gè)時(shí)間的百分比。

3. 取材：于1、2、4、6周四個(gè)行為學(xué)測(cè)試實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)日以及造模結(jié)束常氧飼養(yǎng)1月(即10周)之日，每組處死5只小鼠。海馬取材方法：脫臼法處死小鼠，迅速剖開顱骨，完整取出腦組織，在視交叉后冠狀面剖開腦組織即可見到海馬，再沿正中矢狀面平分腦組織，分左右海馬組織，過液氮后快速-80 ℃凍存，待指標(biāo)檢測(cè)。

4. Western blot 檢測(cè)海馬中NR1蛋白：提取組織蛋白質(zhì)，用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗兔抗小鼠NMDAR1、羊抗兔IgG二抗孵育，化學(xué)發(fā)光，顯影，定影，顯微圖像分析。

5. 激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光標(biāo)記Caspase-3的表達(dá)情況：取新鮮海馬組織，4%多聚甲醛固定30 min，做冰凍切片(厚度為20 um)，漂洗，5%脫脂奶粉封閉，加一抗Caspase-3，F(xiàn)ITC標(biāo)記的驢抗羊二抗孵育，加DAPI(0.3 μg/ml)染細(xì)胞核，90%酒精脫水，熒光抗淬滅封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果

1. 間歇低氧對(duì)小鼠學(xué)習(xí)能力的影響：從間歇低氧第3天起，CIH組小鼠的逃避潛伏期即高于UC組(P>0.05)；隨著間歇低氧時(shí)間的延長，CIH組平均逃避潛伏期均逐漸延長，各組小鼠的逃避潛伏期均明顯高于UC組(P<0.05)，尋找平臺(tái)的時(shí)間較長。完成造模6周的12只小鼠，重新訓(xùn)練迷宮3 d，每天4次，發(fā)現(xiàn)小鼠訓(xùn)練后成績(jī)提高很慢，明顯慢于造模前及對(duì)照組，3 d后測(cè)試的平均逃避潛伏期明顯高于UC組(P<0.01)。大部分對(duì)照組小鼠在造模期間隨著訓(xùn)練次數(shù)的增多，可以在很短時(shí)間內(nèi)找到平臺(tái)，對(duì)照組組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.107，P>0.05)，實(shí)驗(yàn)組組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.004，P<0.01)，見表1，圖1。

2. 間歇低氧對(duì)小鼠記憶成績(jī)的影響：CIH 組120 s內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)為(4.58±2.58)次，較UC組顯著減少[(8.06±2.74) 次，P<0.01]；在平臺(tái)所在象限的游泳時(shí)間與UC組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 造模6周后CIH組與對(duì)照組小鼠記憶能力比較

注：與UC組比較aP<0.01

二、 Westen Blot檢測(cè)各組小鼠海馬神經(jīng)元NR1蛋白表達(dá)的變化

如圖2所示，與對(duì)照組比較，CIH組B、C、E、F及G組，NR1蛋白的表達(dá)均降低，與其對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；其中C、E組降至最低水平(P<0.01)。A組NR1蛋白表達(dá)較其對(duì)照組稍有升高跡象。復(fù)氧1月后的G組NR1蛋白仍較對(duì)照組降低(P<0.01)，NR1蛋白表達(dá)與其F組相仿。

注：A：CIH組，B：UC組

注：*P<0.01

表1 造模過程中各組平均逃避潛伏期比較

注：與UC組比較aP<0.05；bP<0.01；CIH組隨造模時(shí)間延長，組間比較F=5.004，P<0.01；UC組組間比較F=1.107,P>0.05

三、各組激光共聚焦顯微鏡下熒光標(biāo)記Caspase-3的表達(dá)情況

激光共聚焦鏡下，綠色熒光代表胞漿內(nèi)Caspase-3的表達(dá)，蘭色熒光是熒光標(biāo)記的細(xì)胞核。與對(duì)照組比較，CIH組A、B、C、E、F及G組Caspase-3的表達(dá)均升高，除A組外，其余各組與其對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；其中C、E組升高最顯著(P<0.01)，復(fù)氧1月后的G組Caspase-3的表達(dá)仍較對(duì)照組升高(P<0.01)，略低于F組。由A到E組，隨著低氧時(shí)間延長，Caspase-3的表達(dá)有逐漸升高趨勢(shì)，但兩組組間比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見圖3、圖4。

討 論

認(rèn)知功能損害是OSAS最為常見的并發(fā)癥之一，可以表現(xiàn)在記憶、注意、集中、執(zhí)行等功能以及總體智力損害等多方面[9-10]，其中短期記憶力和注意損害是OSAHS患者嚴(yán)重的認(rèn)知障礙[11]。但是，OSAS引起認(rèn)知功能損害的機(jī)制至今尚不完全明確，間歇低氧、睡眠結(jié)構(gòu)破壞、交感神經(jīng)興奮、激活氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)通路，都是認(rèn)知功能損害的可能機(jī)制，但其中確切的分子靶點(diǎn)尚不清楚。

注：與對(duì)照組相比，*P<0.01

圖4 UC組和CIH各組Caspase-3表達(dá)的激光共聚集顯微鏡細(xì)胞圖

本研究中，與對(duì)照組相比，CIH組小鼠水迷宮逃避潛伏期顯著延長，而穿越平臺(tái)次數(shù)顯著降低，表明慢性間歇性低氧對(duì)小鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能均有損害，這一結(jié)果與國內(nèi)外學(xué)者的報(bào)道相一致[12-14]。本研究顯示這種損害發(fā)生在低氧早期，有隨著低氧時(shí)間延長和程度加重而加重的趨勢(shì)，呈時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系，但其機(jī)制尚不明確，可能與海馬對(duì)低氧反應(yīng)的易感性，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)、激活鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)及其相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)，導(dǎo)致海馬結(jié)構(gòu)、功能改變和神經(jīng)元凋亡有關(guān)[15-16]。

本研究通過免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)從間歇低氧3 d開始(A組)即有Caspase-3的活化，2周(C組)時(shí)達(dá)最高峰，并可以維持4周(E組)，以后逐漸減少，但仍高于對(duì)照組；即使復(fù)氧1月(G組)，Caspase-3的表達(dá)仍高于對(duì)照組。細(xì)胞凋亡主要由Caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程控制[7]，而Caspase-3是Caspases家族的核心成員，在蛋白酶級(jí)聯(lián)切割過程中處于核心位置，其表達(dá)與激活在神經(jīng)細(xì)胞的凋亡中扮演重要角色[8]。Westen Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在早期CIH組A組，海馬區(qū)神經(jīng)元NRl蛋白表達(dá)量較對(duì)照組變化有增高趨勢(shì)，而B、C、E、F及G組，小鼠海馬神經(jīng)元NR1蛋白的表達(dá)均降低，其中C、E組降至最低水平。NMDA受體是興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸親離子型受體的一種，目前已發(fā)現(xiàn)存在7個(gè)亞單位，其中NR1是該受體核心的功能亞單位，海馬區(qū)NR1與LTP現(xiàn)象的產(chǎn)生密切相關(guān)。LTP現(xiàn)象是中樞神經(jīng)系統(tǒng)可塑性的一種理想模式，是學(xué)習(xí)和記憶的神經(jīng)基礎(chǔ)[4]，在大多數(shù)LTP的誘導(dǎo)過程中，與NMDA受體藕聯(lián)的Ca2+通道起了重要作用。本研究結(jié)果表明，在CIH早期，興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸增多，刺激NR1激活，但隨著低氧時(shí)間延長，NR1的過度激活，對(duì)腦組織產(chǎn)生興奮性毒作用，引起離子通道病理性開放，Ca2+大量?jī)?nèi)流，造成胞內(nèi)鈣超載，產(chǎn)生大量自由基、神經(jīng)元蛋白質(zhì)和磷脂代謝紊亂，線粒體能量傳遞異常，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡機(jī)制，激活Caspase-9基因和下游的Caspase-3基因，使得海馬神經(jīng)元凋亡[17-18]，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能受損。

本研究認(rèn)為，海馬鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中NR1受體通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈，影響LTP的誘導(dǎo)和維持，使突觸可塑性改變；并介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣超載，激活下游的Caspase-3基因，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而發(fā)揮對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能的調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果對(duì)OSAS導(dǎo)致認(rèn)知障礙的機(jī)制進(jìn)行了初步探討，為進(jìn)一步的干預(yù)治療提供了值得關(guān)注的新靶點(diǎn)。

參 考 文 獻(xiàn)

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