阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征模式間歇低氧對大鼠淋巴細胞亞群凋亡的研究

咼恒娟 李津娜 陳寶元 曹 潔 馮 靖 楊曉燕 姜君男

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea hypopnea syndrome, OSAHS)是指在睡眠期反復發生上氣道阻塞并引起呼吸暫停的一種常見病。該病睡眠時反復出現呼吸暫停，伴隨不同程度的間歇低氧(intermittent hypoxia, IH)[1]。OSAHS是一種全身系統性疾病，炎癥和氧化應激是其主要特征，大量研究表明，白細胞和內皮細胞的激活與相互作用是誘導炎癥和損傷血管的重要因素，導致了心血管并發癥的發展[2]。目前認為動脈粥樣硬化是一個多環節參與的慢性炎癥性疾病，具有自身免疫的特征，涉及多種可溶性介質、單核細胞、淋巴細胞、內皮細胞和平滑肌細胞的相互作用，其中白細胞與內皮細胞黏附是動脈粥樣硬化形成的始動環節[3]。在OSAHS模式下，間歇低氧激活淋巴細胞，被激活的淋巴細胞表達黏附分子、細胞因子及釋放細胞毒素，與內皮細胞的黏附增加，加重內皮細胞損傷，加速動脈硬化的形成。因此淋巴細胞和內皮細胞的激活和相互作用在誘導炎癥和損傷內皮中占重要作用[4]。

目前認為OSAHS模式IH可延遲中性粒細胞的凋亡，從而加重中性粒細胞對血管內皮細胞的損傷[5]，但IH對淋巴細胞亞群的凋亡有何影響尚不清楚，本研究模擬OSAHS建立IH大鼠模型，觀察IH模型大鼠淋巴細胞亞群的凋亡狀態，旨在為闡明OSAHS導致內皮損傷的機制提供實驗依據。

材料和方法

一、試劑與材料

研究試劑與材料： ①Wistar大鼠由中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所動物實驗中心提供；②Tempol及Histopaque雙密度梯度分離液 (Sigma-Aldrich)；③抗體(Becton Dickinson)；④臺盼藍染液 (上海迪申生物技術有限公司)；⑤吉姆薩染液 (南京建成科技有限公司)；⑥混合氣(天津六方氣體有限公司)；⑦全無油潤滑空氣壓縮機(上海捷豹壓縮機制造有限公司丹崖分公司)；⑧醫用型氧濃度分析儀(建德市梅城電化分析儀器廠)；⑨空氣凈化器(浙江溫嶺市澤國空壓機有限公司)；⑩流式細胞儀(Becton Dickinson)。

二、實驗方法

1. 大鼠分組及IH干預：將16只雄性Wistar大鼠隨機分為2組,每組8只：①常氧對照組(normal oxygen, NC)：向低氧艙內持續充入壓縮空氣(流速6 L/min)，使氧艙內氧濃度始終維持在21%；②IH 4周組(IH4)：間歇低氧頻率為30次/h，低氧艙內最低氧濃度為5%，向低氧艙內循環充入純氮氣30 s(流速10 L/min)，壓縮空氣50 s(流速16 L/min)使艙內氧濃度恢復，壓縮空氣40 s(流速6 L/min)常氧維持，每2 min為1循環，使低氧艙內氧濃度在5%～21%間循環，達到低氧-復氧的目的。

2. 淋巴細胞的分離：暴露4周結束后，各組大鼠均于清晨空腹給予3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，經腹主動脈取血后收集肝素抗凝血液標本8～10 ml。使用雙層Ficoll-Histopaque (Histopaque 1.083和1.119)雙密度梯度離心法分離淋巴細胞，按廠家說明書操作。將純化的淋巴細胞在無血清RPMI-1640培養基中重懸，細胞計數板計數，調整細胞濃度為1×106/ml。臺盼藍染色計算所分離淋巴細胞的存活率，吉姆薩染色確定其純度。

3. 流式細胞術檢測大鼠外周血CD4 T、CD8 T、NK、B細胞的凋亡情況: 使用冰PBS緩沖液洗細胞2次，再用1×Binding Buffer緩沖液重懸為1×106/ml的懸液，標號試管1-4，1號試管加CD45RA FITC-Ab 5 μl，2號試管同時加CD3 APC-Ab和CD4 FITC -Ab 5μl，3號試管同時加CD3 APC-Ab和CD8 a FITC-Ab 5 μl，4號試管同時加CD3 APC-Ab和CD161 a FITC-Ab 5μl，向每個試管中加入100 μl細胞懸液(1×106/ml)。4 ℃避光孵育15 min，向每只試管中均加入凋亡緩沖液1 ml，以離心半徑8 cm，1500 r/min離心 10 min，洗滌5 min，棄上清并向每只試管中加100 μl凋亡緩沖液，并同時加入5 μl的Annexin V PE和5 μl的7-AAD。輕輕混勻，于室溫(20～25 ℃)避光放置15 min。向每個試管中加入1×Binding Buffer緩沖液400 μl，于1 h內流式細胞術檢測細胞凋亡。

三、統計學方法

結 果

如圖1和2所示，IH組CD4 T細胞凋亡率(15.17±1.43)%低于NC組(17.97±1.76)%，CD8 T細胞凋亡率(17.23±1.07)%低于NC組(19.71±1.93)%，NK細胞凋亡率(22.07±1.45)%高于NC組(17.33±1.04)%，B細胞凋亡率(17.88±1.85)%高于NC組(13.94±1.76)% (P均<0.01)。

注：A：CD4 T細胞；B：CD8 T細胞；C：NK淋巴細胞；D：B淋巴細胞

注：*P<0.01 vs. 對照組

討 論

OSAHS是一種伴隨心血管疾病嚴重后果的常見疾病，具有誘發高致死性和非致死性心血管事件的風險，與心血管疾病的發病率和病死率相關。OSAHS心血管并發癥的發病機制尚不完全清楚，可能與多因素交互作用有關。OSAHS可促進氧化應激的產生以及炎性細胞的激活[5]。白細胞的激活以及其與內皮細胞的相互作用，可導致內皮細胞功能障礙，進一步誘發動脈粥樣硬化等心血管疾病的發生和發展[4]。Dyugovskaya等[6]研究發現OSAHS患者的中性粒細胞凋亡延遲，并可進一步加重炎性反應和內皮細胞的損傷。但目前睡眠呼吸暫停模式間歇低氧對大鼠外周血淋巴細胞亞群凋亡的影響鮮有報道。本研究表明，IH對淋巴細胞亞群的凋亡具有不同的調節作用，IH可延遲CD4、CD8 T細胞的凋亡，但可加速NK和B細胞的凋亡。

T細胞作為炎性細胞在IH誘導的內皮功能障礙中發揮著重要的作用，在OSAHS患者中，T細胞可通過浸潤直接損傷或通過炎癥因子的釋放損傷內皮細胞。Dyugovskaya等[7-9]通過流式細胞儀和鉻釋放方法，發現OSAHS患者的CD4、CD8和γδ T細胞有細胞顯型和功能的改變，造成對內皮細胞的毒性顯著增加。本研究顯示IH可導致CD4、CD8 T細胞凋亡減少，即CD4、CD8 T細胞生存期延長，其可能是累積炎性和毒性細胞的一種機制，進而促進內皮細胞的損傷和動脈粥樣硬化的發展。Gaber等[10]研究表明病理性低氧(<2% O2)可顯著降低人CD4 T細胞的存活，而生理低氧(5% O2)并不降低其存活，這與我們的研究結果并不一致。因此，低氧對CD4 T細胞存活的影響可能與低氧模式、低氧濃度以及細胞株類型相關。

NK細胞在動脈硬化的過程中亦發揮著重要作用。正常情況下，NK細胞能夠控制感染和自身免疫性疾病。NK細胞功能的喪失可能會使機體易于感染動脈粥樣硬化相關的病原體，從而導致斑塊負擔增加和易損斑塊的形成[11]。此外，NK細胞減少可能會導致機體在免疫防御、免疫監視及免疫自身穩定功能等方面的下降，從而導致一系列疾病如腫瘤等發生率的增高。本研究顯示IH可導致大鼠外周血NK細胞的凋亡增加，可能促使機體對動脈粥樣硬化相關病原體的易感性，從而加重動脈粥樣硬化的發展。此外亦有文獻報道[12-15]，OSAHS患者的腫瘤發病率和病死率明顯升高，其可能與NK細胞的凋亡率增加相關。IH促使NK細胞凋亡增加的機制尚不清楚，Hansson等[16]研究證實，外源性H2O2可促使NK細胞凋亡，但加入H2O2清除劑后凋亡降低，提示NK細胞的凋亡與氧化應激相關。本研究中，IH激發的氧化應激是否參與了NK細胞的凋亡，尚有待進一步的研究。B細胞參與動脈硬化的發展，基于B細胞的亞型不同，具有抗動脈硬化與促動脈硬化的雙重效應[17]，其作用較復雜。本研究中IH促使B細胞凋亡增加，但其真正的臨床意義尚不明確。

本實驗模擬OSAHS導致的IH，研究其對大鼠外周血淋巴細胞亞群凋亡的影響。結果表明IH對CD4、CD8 T細胞以及NK、B細胞的凋亡表現出不同的調節作用，可導致免疫細胞的凋亡紊亂和功能異常，對OSAHS患者相關的疾病如動脈粥樣硬化和腫瘤可能具有一定的臨床意義，值得關注并進一步深入研究。

參 考 文 獻

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