Bcl-2、VEGF、MMP-2在結(jié)腸黏液腺癌的表達(dá)及臨床意義

張劍虹，張 飛，張曉麗，林媛媛，劉君超

(1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 病理科；2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 放療科；3.河北北方學(xué)院，張家口075000)

結(jié)腸黏液腺癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，影響預(yù)后因素很多，其中與腫瘤細(xì)胞的過(guò)度增殖及新血管的生成有關(guān)。最近研究表明原癌基因Bcl-2、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)VEGF、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)可影響結(jié)腸黏液腺癌的生物學(xué)行為。

本研究通過(guò)免役組化及組織芯片技術(shù)檢測(cè)結(jié)腸黏液腺癌中Bcl-2、VEGF、MMP-2的表達(dá)情況，探討其與結(jié)腸黏液腺癌發(fā)生、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料收集我院 2003-2012年結(jié)腸黏液腺癌手術(shù)切除標(biāo)本91例，其中男性49例，女性42例；年齡32-86歲，平均59歲，≥40歲 55例，<40歲36例；結(jié)腸黏液腺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)按WHO腸道腫瘤組織學(xué)分型進(jìn)行，所有樣本切片均經(jīng)組織學(xué)證實(shí)。組織學(xué)分級(jí)高分化29例，中低分化62例；TNM分期Ⅰ-Ⅱ期 37 例，Ⅲ-Ⅳ期54例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48 例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43 例。所有患者均為首次發(fā)病，無(wú)腸癌家族遺傳史，術(shù)前均未接受過(guò)放化療及免疫治療。

1.2組織芯片制備

組織芯片委托試劑公司在天津腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所完成。

1.3免疫組織化學(xué)方法

采用免疫組織化學(xué)SP法，相關(guān)試劑：Bcl-2鼠單克隆抗體工作液，VEGF鼠抗人單克隆抗體工作液、MMP-2鼠單克隆抗體工作液、SP免疫組化試劑盒、DAB顯色劑用生物素標(biāo)記，均購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司。主要免疫組織化學(xué)步驟：石蠟包埋組織切片4 μm厚，常規(guī)脫蠟至水，0.3%過(guò)氧化氫室溫下10 min,以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；充分水洗，與pH6.0的檸檬酸緩沖液中高壓鍋處理10 min后，室溫冷卻；非免疫羊血清封閉10 min后，加入即用型鼠單抗Bcl-2、VEGF和MMP-2，4冰箱過(guò)夜，再加入生物素化羊抗鼠IgG和S-P復(fù)合物。以DAB液顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，封片。用TBS代替一抗作陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照。

1.4結(jié)果判斷Bcl-2、VEGF、MMP-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)均主要定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜，有棕黃色染色顆粒認(rèn)為陽(yáng)性細(xì)胞。根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行半定量的綜合計(jì)分。隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野數(shù)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞百分比的平均數(shù)，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)0分，<25%計(jì)1分，26%-50%計(jì)2分，51%-75%記3分，>75%記4分；著色強(qiáng)度以多數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)的染色計(jì)分，無(wú)著色計(jì)0分，淺黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分；棕褐色計(jì)3分；將陽(yáng)性細(xì)胞百分比和著色強(qiáng)度兩者的計(jì)分相加，0-1分為陰性(-)，>3分為陽(yáng)性(+)。本實(shí)驗(yàn)所有免疫組化切片均由兩名病理科主治醫(yī)師雙盲法讀片，差異出現(xiàn)5-10%，然后共同決定診斷。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。組間表達(dá)率的比較采用Fisher精確概率法。

2 結(jié)果

2.1結(jié)腸黏液腺癌、癌旁組織中Bcl-2、VEGF、MMP-2的表達(dá)情況見表1。

91例結(jié)腸黏液腺癌標(biāo)本中，Bcl-2、VEGF、MMP-2的免役組織化學(xué)染色顯示細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜內(nèi)出現(xiàn)不程度棕黃色顆粒(圖1～圖3)，其陽(yáng)性率分別為68.13%例、53.85%、60.43%，呈現(xiàn)高表達(dá)。在癌旁組織低表達(dá)，表達(dá)率分別為36.26%、30.76%、25.27%，3項(xiàng)指標(biāo)各組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.χ2=18.52，P<0.01;2.χ2=9.93，P<0.01;3.χ2=10.35，P<0.01)。

表1 結(jié)腸黏液腺癌、癌旁組織中Bcl-2、VEGF、MMP-2的表達(dá)情況

注：癌旁組織距離腫瘤邊緣4厘米，經(jīng)病理檢查未發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞 1，2，3相比P<0.01

2.2Bcl-2、VEGF、MMP-2表達(dá)與結(jié)腸黏液腺癌的臨床病理資料的關(guān)系，見表2。

Bcl-2、VEGF、MMP-2表達(dá)與患者性別，年齡無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)， Bcl-2、VEGF、MMP-2的表達(dá)與腫瘤的病理分化程度相關(guān)，中低分化組表達(dá)率高于高分化組(P<0.05)；Bcl-2、VEGF、MMP-2的表達(dá)與TNM分期相關(guān)，Ⅲ+Ⅳ期組表達(dá)率高于Ⅰ+Ⅱ期組(P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中Bcl-2、VEGF、MMP-2的陽(yáng)性率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.05)。

表2 Bcl-2,VEGF和MMP-2的表達(dá)與結(jié)腸黏液腺癌的臨床病理參數(shù)的關(guān)系

注：★χ2=14.03，※χ2=4.34，●χ2=7.31，◆χ2=17.79，■χ2=8.78，▲χ2=10.33，☆χ2=17.55，○χ2=9.08，△χ2=11.77，P<0.05

圖1 結(jié)腸粘液腺癌的VEGF的表達(dá)(SP×200)

圖2 結(jié)腸粘液腺癌Bcl-2的表達(dá)(SP×200)

3 討論

原癌基因Bcl-2是細(xì)胞凋亡抑制基因，當(dāng)Bcl-2基因被激活，使Bcl-2蛋白表達(dá)升高，使細(xì)胞凋亡受到抑制，細(xì)胞的生存期就被延長(zhǎng)，可使變異細(xì)胞容易聚集，最終致使細(xì)胞發(fā)生癌變[1]。在不同類別的腫瘤中，Bcl-2的表達(dá)強(qiáng)弱與腫瘤病理組織學(xué)分級(jí)，臨床分期和轉(zhuǎn)歸有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)91例結(jié)腸黏液腺癌及癌旁組織中Bcl-2的表達(dá)，結(jié)果顯示結(jié)腸黏液腺癌組織中Bcl-2表達(dá)率為68.13%，高于癌旁組織36.26%的表達(dá)率。說(shuō)明Bcl-2蛋白的過(guò)多表達(dá)限制了結(jié)腸正常腺體細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)了細(xì)胞的生存期，破壞了細(xì)胞凋亡與增殖的動(dòng)態(tài)平衡，使變異細(xì)胞容易聚集，從而正常細(xì)胞發(fā)生癌變。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)Bcl-2的表達(dá)與患者性別，年齡無(wú)關(guān)，而與病理組織學(xué)分化程度，TNM分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。中低分化的結(jié)腸黏液腺癌，Bcl-2的陽(yáng)性表達(dá)率高于高分化者，TNM分期Ⅲ-Ⅳ期的結(jié)腸黏液腺癌患者Bcl-2的陽(yáng)性表達(dá)率高于Ⅰ-Ⅱ期，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的Bcl-2的陽(yáng)性表達(dá)率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Bcl-2蛋白過(guò)表達(dá)，癌細(xì)胞正常的凋亡能力受限，癌細(xì)胞過(guò)速生長(zhǎng)，使其具有更強(qiáng)的生物學(xué)行為，更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，正如本實(shí)驗(yàn)觀察到Bcl-2高表達(dá)的患者具有較高的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率，具有較強(qiáng)的惡性程度。

圖3 結(jié)腸粘液腺癌MMP-2的表達(dá)(SP×200)

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，它是一種選則性內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂素，可以使血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，從而形成微血管，促進(jìn)癌組織結(jié)構(gòu)內(nèi)的微血管產(chǎn)生，腫瘤生長(zhǎng)，浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移與之密切相關(guān)[2]。血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化增埴和遷移與VEGF的刺激有關(guān)，VEGF可促使內(nèi)皮細(xì)胞移位，使細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生變化，血管通透性增加，VEGF提供營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和新血管形成，為癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移提供了條件。大量研究證實(shí)[3，4]，VEGF在大多數(shù)惡性腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，且與癌細(xì)胞血管形成密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)VEGF在結(jié)腸黏液腺癌組織表達(dá)率為53.85%，癌旁組織表達(dá)率為30.76%，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此可見VEGF促進(jìn)了癌組織內(nèi)微血管的生長(zhǎng)，為癌細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)癌腫形成。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)結(jié)腸黏液腺癌的臨床分期越高VEGF的表達(dá)率越高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組其VEGF的表達(dá)率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，病理組織學(xué)分級(jí)中低分化組VEGF的表達(dá)率高于高分化組，這些顯示VEGF高表達(dá)預(yù)示著癌組織具有更強(qiáng)的侵襲性，更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處播散，預(yù)示較高的臨床分期和不良預(yù)后，VEGF可作為結(jié)腸黏液腺癌惡性分化程度和預(yù)后因素的指標(biāo)之一。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)對(duì)基膜和細(xì)胞外基質(zhì)的降解在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中起著重要的作用[5]，MMP-2是MMPs中的明膠酶類， 其表達(dá)量在正常組織非常少，在腫瘤組織中其表達(dá)量增加，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)性生長(zhǎng)。MMP-2在不同人體腫瘤組織中表達(dá)不一，陳友權(quán)[6]等研究發(fā)現(xiàn)MMP-2在胃癌中的表達(dá)程度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，漿膜侵犯，臨床分期呈正相關(guān)。翟峰[7]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MMP-2在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的陽(yáng)性表達(dá)率較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示結(jié)腸黏液腺癌組織中MMP-2表達(dá)率為60.43%，高于癌旁組織25.27%的表達(dá)率，表明MMP-2的表達(dá)越高，其降解的細(xì)胞外基質(zhì)能力越強(qiáng)，細(xì)胞外基質(zhì)是癌細(xì)胞之間的物質(zhì)，細(xì)胞外基質(zhì)被降解掉，從而癌細(xì)胞越容易聚積，癌腫越容易形成，MMP-2的高表達(dá)與結(jié)腸黏液腺癌的發(fā)生有密切關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)隨著臨床分期的升高，MMP-2的表達(dá)率也升高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組其MMP-2的表達(dá)率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，病理組織學(xué)分級(jí)中低分化組MMP-2的表達(dá)率高于高分化組。表明MMP-2的表達(dá)越高結(jié)腸黏液腺癌的生物學(xué)行為越強(qiáng)，越容易發(fā)生侵襲，轉(zhuǎn)移，其機(jī)制驗(yàn)證MMP-2主要通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)和基膜成分，調(diào)節(jié)癌細(xì)胞與基質(zhì)和基膜的黏附，激活具有潛在活性的蛋白質(zhì)等作用來(lái)促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲，轉(zhuǎn)移。

總之在不同惡性程度的腫瘤中，Bcl-2，VEGF，MMP-2在結(jié)腸黏液腺癌的表達(dá)有相關(guān)作用。說(shuō)明以上三者均與腫瘤的侵襲，轉(zhuǎn)移有關(guān)，并在腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移機(jī)制中起重要作用，可作為檢測(cè)結(jié)腸黏液腺癌的預(yù)后的參考指標(biāo)。但三者之間是怎樣相互影響及怎樣作用于結(jié)腸黏液腺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制目前尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

作者簡(jiǎn)介：張劍虹，女，41歲，副主任醫(yī)師，研究方向：結(jié)腸癌相關(guān)基因表達(dá)與治療，預(yù)后的相關(guān)性研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]SanzL,Garcia Marco JA,Casanova B,et al Bcl-2 family gene modulation during spontaneous apoptosis of B-chronic lymphocytic leukemia cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,315(3):562.

[2]閻洪濤，龔百生，廖 勇，等．膀胱移行細(xì)胞癌組織中P53和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的關(guān)系及臨床意義[J]．中華泌尿外科雜志，2006，27(3)：178．

[3]高曉來(lái)．肺癌患者血清Survivin和VEGF的表達(dá)及其臨床意義[J]．臨床肺科雜志，2012，17(1)：109．

[4]何靜華，高 放，張鳳梅，等Np63，VEGF和PCNA在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)及其與腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J]．中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2012，19(6)：12．

[5]Sampieri C L,de la Pena S,Ochoa-lara M,et al.Expression of matrix metalloproteinases 2 and 9 in human gastric cancer and superficial gastritis[J].World J Gastroenterol,2010,16(12):1500.

[6]陳友勸，于燕妮．胃癌中SDF-1，CXCR4，MMP-2和MMP-9的表達(dá)及意義[J]．臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2012，28(2)：135．

[7]翟 峰，乳腺癌組織中VEGF的表達(dá)與CD44v6,MMP-2的相關(guān)性研究[J]．河北醫(yī)藥，2012，34(6)：808．

[8]Di Domenico M,Ricciardi C,Fusco A,et al.Anti-VEGF therapy in breast and lung mouse models of cancers[J].J Biomed Biotechnol,2011:928.

[9]Di Domenico M,Ricciardi C,Fusco A,et al.Anti-VEGF therapy in breast and lung mouse models of cancers[J].J Biomed Biotechnol,2011:928.

[10]Yu HB,Zhang HF,Zhang X,et al.Resveratrol inhibits VEGF expression of human hepatocellular earcinoma cells through a NF-kap-pa B-mediated mechanism[J].Hepatogastrology,2010,57:1241.