高通量測序技術在慢性咽炎患者咽部細菌耐藥基因檢測中的應用價值

汪常偉，魏妍慧，李彥華

(新疆醫科大學附屬中醫院 耳鼻喉科，新疆 烏魯木齊830000)

慢性咽炎是耳鼻咽喉科中的常見疾病，其發病率較高，占咽部疾病的10%-20%[1]，很多疾病或感染容易發生慢性咽炎并發癥，對患者的生活質量產生較大的影響。為研究慢性咽炎的耐藥性問題，本研究選取2010年5月至2012年5月我院收治的360例慢性咽炎患者，對其咽分泌物中的質粒DNA進行高通量測序，旨在分析慢性咽炎患者咽部細菌耐藥基因的分布情況，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年5月至2012年5月我院收治的慢性咽炎患者360例，男204 例，女156 例，年齡35-71歲，平均年齡48.35歲，病程最短6個月，最長12年，平均病程6.13年，其中慢性肥厚性咽炎258例，慢性單純性咽炎69例，慢性干燥性咽炎33例。患者均符合耳鼻咽喉科學咽科學(第六版)[2]慢性咽炎診斷標準。排除標準：近2 周內全身或局部未曾應用抗菌藥物，且無口腔、鼻竇、喉及下呼吸道疾患。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 囑患者取樣前2h不進食 采集標本前受檢者用無菌生理鹽水漱口2-3次，無菌操作將無菌咽拭子于咽后壁反復涂抹數次后插入無菌試管中塞緊送檢。

1.2.2 質粒DNA的提取 采用FastDNA Soil Kit(MP Biomedicals,CA,USA)提取咽后壁分泌物DNA，采用顯微分光光度計(NanoDropH ND-1000,NanoDrop Technologies,Willmington,DE)測量DNA濃度，采用QIAGEN Plasmid Mini Kit(QIAGEN SCIENCES INC,Germantown,MD,USA)從約100 mg DNA中提取質粒DNA，并按照試劑盒說明書，在1 mg 質粒DNA中加入ATP-dependant Plasmid SafeDNase(Epicentre，USA)進行保護。質粒DNA于37 ℃孵育過夜，隨后在70 ℃熱擊30 min，并置于冰上，用于后續質粒提取及Illumina測序。為了評估質粒富集度，采用qPCR法[3]檢測其相對豐度，采用16S rRNA基因作對照以排除檢測質?；蚪M中的染色體DNA污染。PCR反應引物參考已報道引文[4]中的341 F和518 R。

1.2.3 Solexa高通量測序 純化后的PCR產物進行Solexa高通量雙向測序。應用超聲法將序列打斷至約180 bp，末端分別加上接頭，通過接頭PCR將DNA片段連接到芯片上形成“橋”(Bridge)，并制成文庫，隨后應用4種熒光標記的核苷酸通過橋式PCR(Bridge PCR)進行邊合成邊測序(Sequencing By Synthesis，SBS)，獲得原始讀長數據。

1.2.4 質控 所有的讀長序列均需經過預處理，從而提高堿基識別分辨率，減少誤差，通過篩除測序質量較低的序列、接頭序列(adapter)、長度<40 bp的序列以及污染序列，最終獲得高質量序列。

1.2.5 物種鑒定 NCBI質粒基因組數據庫收錄了目前已知的質粒基因組序列，我們把重疊群序列測序得到的原始序列比對到NCBI質?；蚪M數據庫，鑒定該序列的物種來源。使用BWA軟件進行短序列的比對，參數設為-i 10 -t 8 -R 100 -q 20。

1.2.6 耐藥基因的鑒定 使用velvet 軟件對上一步質控獲得的高質量序列進行拼接得到重疊群序列，Kmer設置為40。ARDB數據庫收錄了目前已知的絕大部分耐藥基因，使用blast軟件把拼接得到的重疊群序列與ARDB數據庫進行比對，如果比對的identity大于90%和25個以上氨基酸，則認為這條序列屬于耐藥基因。

2 結果

2.1 病原菌分布情況

共有4 276 161條短序列能夠比對到NCBI質?；蚪M數據庫。共鑒定出307個質粒，分屬25種病原菌。在慢性咽炎患者咽后壁分泌物中細菌感染所占比例最高的為α-溶血性鏈球菌(12.87%)，其次依次為副流感嗜血菌(9.86%)、卡他莫拉菌(9.39%)、表皮葡萄球菌(7.07%)，其它病原菌在7%以下，見表1。

表1 慢性咽炎患者咽后壁分泌物質粒測序結果

2.1 質粒宏基因組中ARG檢測情況

通過與抗生素抗性基因數據庫(Antibiotic Resistance Database，ARDB)中已知的380種ARG(編碼249種抗生素抗性的基因)的23 137條序列進行比對，我們發現共有4015條序列與已知耐藥基因序列一致。其中氨基糖苷類耐藥基因、β內酰胺酶類耐藥基因、大環內酯類耐藥基因及四環素類耐藥基因占較高的比例。同時，我們也檢測到一個多重耐藥基因 lsa，見圖1。

圖1 耐藥基因分布

3 討論

慢性咽炎是咽黏膜、黏膜下以及淋巴組織的彌漫性慢性炎癥，常為上呼吸道慢性炎癥的一部分，也是耳鼻喉科的常見疾病[5，6]。由于咽部是人體重要的儲菌庫，所以咽部細菌的分布可能與慢性咽炎發病原因、機制存在一定的關系，而細菌的耐藥分析則可以為臨床醫師的治療方案選擇提供依據[7]。對于慢性咽炎，臨床上大多采用抗生素類藥物進行治療，或輔以地塞米松等激素類制劑，但療效較差，易反復發作。如果治療不當，極易產生抗藥菌株，抗藥菌株的抗藥基因可以在不同菌種之間進行轉移，導致其他菌株耐藥。

病原菌耐藥性的檢測方法很多，但所需時間都較長[8]，以培養為基礎的絕對濃度法或比例法需要2-3 個月才能得到藥敏結果，放射性快速診斷技術可將耐藥檢測縮短到2-4周，但仍不能滿足臨床需要。而且普通培養僅是其中一部分，相比之下，基因芯片技術及高通量測序技術可以直接對樣品中的耐藥基因進行檢測，操作較為簡單，鑒定周期短，具有很高的臨床應用潛在價值[9，10]。目前，國內外對耐藥芯片的相關報道較多，對高通量測序檢測耐藥基因的研究幾乎還是空白。以培養為基礎的研究方法，適合小樣本的研究，芯片技術不能夠定量，而高通量測序技術能夠進行大范圍群體的研究。本研究讓我們第一次從群體的角度，確切的知道了耐藥基因在慢性咽炎患者中的分布情況，對慢性咽炎的基礎研究提供了極高的參考價值。

本研究共鑒定出307個質粒，分屬25種病原菌，所占比例最高的為α-溶血性鏈球菌(12.87%)，其次為副流感嗜血菌(9.86%)。通過與ARDB中已知的380種ARG比對，共有4015條序列與已知耐藥基因序列一致。其中氨基糖苷類耐藥基因、β內酰胺酶類耐藥基因占較高的比例。同時我們也檢測到一個多重耐藥基因 lsa。高通量測序技術可以高效、準確地檢測慢性咽炎患者中的耐藥基因，為臨床慢性咽炎治療方案的選擇提供理論基礎。

參考文獻：

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