骨髓間充質(zhì)干細胞對慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜患者T細胞T-bet和 GATA-3表達的影響

姜 鏵，龍志國，張 霞， 夏云金，章正華，萬楚成

(湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院 血液內(nèi)科， 湖北 十堰 442000)

慢性免疫性血小板減少癥(Chronic immune thrombocytopenia，cITP )是一種臨床上常見的出血性自身免疫性疾病，約占出血性疾病的30%，其發(fā)病機制尚未完全闡明，大量研究表明ITP患者體內(nèi)存在T淋巴細胞異常，其中T細胞亞群功能和比例失調(diào)在其發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。目前臨床上ITP的治療主要采用糖皮質(zhì)激素以及脾臟切除、免疫抑制劑，約有1/3患者發(fā)展成難治性ITP，需要長期治療，產(chǎn)生較多的毒副作用，嚴重影響患者的生活質(zhì)量及生命安全。因此，尋找一種行之有效且毒副作用較少的生物免疫療法成為ITP患者治療的研究熱點和難點，研究發(fā)現(xiàn)cITP患者體內(nèi)存在著間充質(zhì)干細胞的功能異常[1]，使用正常人間充質(zhì)干細胞可以平衡ITP患者的免疫抑失調(diào)，但對于其具體機制尚不明了，本文通過體外實驗檢測間充質(zhì)干細胞對cITP患者T淋巴細胞的T-bet和GATA-3表達的影響，以期進一步闡述其機制，為臨床上的應用打下堅實的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 正常人骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、體外擴增和鑒定

骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)骨髓穿刺術(shù)從我院正常健康人獲得，6 ml含肝素抗凝的骨髓液在2 h內(nèi)加入等量的PBS混勻后加入到含有Ficoll分離液的15 ml的離心管中，1 500轉(zhuǎn)/min離心20 min，獲得單核細胞并計數(shù)，將1×108cells/L的細胞懸液10 ml接種到含100 ml/L FBS的α-DMEM培養(yǎng)液中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，3天后換液并洗去未貼壁細胞，細胞融合至90%時使用胰蛋白酶消化并并傳代，重復以上步驟，富集MSCs。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準，所有入選者均簽署知情同意書。

1.2 ITP患者T細胞的分離

T細胞的分離參照文獻報道方法[2]，cITP患者的外周血經(jīng)密度梯度法分離外周血單核細胞，尼龍棉柱法分離T淋巴細胞，調(diào)整細胞密度至1×109cells/L重懸于RPMI培養(yǎng)液中備用。

1.3 ITP患者T淋巴細胞的分離及與骨髓間充質(zhì)干細胞的共培養(yǎng)

共培養(yǎng)方法參照以往文獻報道[2]，將己達到融合狀態(tài)的骨髓MSCS胰酶消化后離心，完全培養(yǎng)液洗滌之后計數(shù)，以5×104cells/孔接種于24孔板，細胞完全貼壁后加入MMC(25 g/L)去增殖處理，用5×104骨髓MSCs與ITP患者的T淋巴細胞(2×105cells/well)接種至24孔板中，同時加入植物血凝素(PHA，50 mg/L)，實驗分為四組：1，骨髓間充質(zhì)細胞+PHA；2，cITP患者T細胞+PHA；3，cITP患者T細胞+地塞米松 +PHA，4，cITP患者T細胞+骨髓間充質(zhì)細胞+PHA，地塞米松組的劑量參照以往文獻，最終藥物終濃度為5×10-5mol/L[3]。

1.4 ELISA法檢測血清中IFN-r和IL-4的表達

IFN-Y和IL-4的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(ELISA)購自杭州聯(lián)科生物，操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.5 RT-PCR

根據(jù)標準的RNA提取步驟提取總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)進行反轉(zhuǎn)錄，具體操作根據(jù)說明書進行。利用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測各組T-bet和GATA-3的表達，以β-actin作為內(nèi)參照，Image J軟件定量分析各電泳條帶的灰度值，RT-PCR產(chǎn)物以各樣本目的基因與β-actin的灰度值進行比較，引物序列參照以往文獻[4]，內(nèi)參基因的上游引物5′TTGCCGACAGGATGCAGAA3′，下游引物5′GCCGATCCACACGGAGTACT3′，T-bet的上游引物5′CATTGCCGTGACTGCCTACC 3′，下游引物5′GATGCTGGTGTCAACAGATGTG 3′，GATA-3 mRNA上游引物5′GAGATGGCACGGGACACTAC 3′，下游引物5′TGTGGTTGTGGTGGTCTGAC 3′。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 骨髓間充質(zhì)干細胞對T細胞分泌細胞因子IL-4和IFN-r的影響

本實驗中沒有檢測到骨髓間充質(zhì)干細胞本身分泌IL-4和IFN-r，與T淋巴細胞+PHA組相比，骨髓間充質(zhì)細胞共培養(yǎng)和糖皮質(zhì)激素顯著降低ITP患者T淋巴細胞分泌IFN-r (P<0.05)，促進了IL-4的表達量(P<0.05);糖皮質(zhì)激素組與間充質(zhì)細胞共培養(yǎng)組相比，兩者對IL-4和IFN-r的分泌作用無顯著性差異(P>0.05)，見表1。

表1 各組IL-4和IFN-r的表達水平(n=10)

*P<0.05與ITP患者T細胞+PHA組相比。

2.2 骨髓間充質(zhì)干細胞對T淋巴細胞中T-bet、GATA-3表達的影響

與PHA單純刺激組相比，骨髓間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)組ITP患者T淋巴細胞T-bet的mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)，GATA-3的mRNA表達水平顯著降低 (P<0.05)；兩組間T-bet/GATA-3的比值明顯降低(P<0.05)，與糖皮質(zhì)激素組相比，骨髓間充質(zhì)干細胞對T淋巴細胞中T-bet和GATA-3表達的影響沒有顯著差異(P>0.05)，見圖1，表2。

(1，cITP T細胞+PHA；2，cITP T細胞+地塞米松+PHA ；3，cITP T細胞+間充質(zhì)細胞+PHA)

圖1 RT-PCR檢測T細胞中T-bet和GATA-3的表達結(jié)果

*P<0.05與cITP患者T細胞+PHA組相比。

3 討論

以往研究發(fā)現(xiàn)ITP患者抗血小板自身抗體受Th細胞和它產(chǎn)生的細胞因子調(diào)控，T細胞的分化本身具有一定的可塑性，其分化受多種內(nèi)外因素的共同影響，免疫反應的調(diào)節(jié)異常將促使ITP患者建立了一個新的Th1/Th2的平衡[5]，目前研究已經(jīng)證實ITP是一種Th1優(yōu)勢性的自身免疫性疾病[6,7]，以利于器官特異性自身免疫的誘導，這些與血小板計數(shù)減少有顯著相關(guān)性[8]。轉(zhuǎn)錄因子GATA -3和T-bet在Th細胞分化調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，轉(zhuǎn)錄因子GATA-3是所有Th2細胞轉(zhuǎn)錄因子所必須的，是Th2細胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子，主要作用是促使正在分化或已經(jīng)分化的Th細胞合成及分泌Th2細胞因子。T-bet最初是在小鼠Th1細胞株中發(fā)現(xiàn)的，主要作用是阻斷或抑制Th2細胞分化信號，以及誘導定向分為Th2的細胞向Th1細胞方向分化。國內(nèi)外研究同時發(fā)現(xiàn)慢性血小板減少性紫癜患者外周T細胞高表達T-bet，低表達GATA-3，導致T-bet/GATA-3比值升高[9]。T-bet對于Th1細胞的發(fā)育發(fā)正調(diào)控作用：T-bet的表達增高導致Th1細胞的分化；GATA3對于水平降低則導致Th2細胞的含量降低，最終導致ITP患者體內(nèi)Th1的優(yōu)勢表達。Th1細胞分泌的細胞因子主要是IFN-γ、IL-2和TNF-a，其中分泌IFN-γ為其主要特征性[10]。Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等，以分泌IL-4為特征[10]，因而在有Thl和Th2失衡的研究中多以IFN-γ代表Th1類細胞因子，以IL-4代表Th2類細胞因子。研究發(fā)現(xiàn)ITP患者血小板計數(shù)的減少與細胞因子IL-2和IFN-γ的明顯增加，以及IL-4和IL-10的降低有顯著相關(guān)性，進一步佐證了ITP患者Th1/Th2失調(diào)的理論。因此本實驗選擇IL-4和IFN-γ作為cITP患者T細胞功能的檢測指標。

骨髓間充質(zhì)干細胞不具有或者具有很低的免疫原性，可以抑制同種或自體T細胞反應[11]，主要作用可能是調(diào)節(jié)細胞內(nèi)各亞群的比例以消減免疫反應的放大[12]，具體機制是：降低Th1亞群的含量，進而下調(diào)的IL-2和IFN-γ的表達量，抑制Th1細胞及巨噬細胞的抗原呈遞能力，間接抑制殺傷細胞的活性，抑制免疫活性T淋巴細胞的增殖；增加Th2亞群含量，導致其分泌的IL-4和IL-10細胞因子含量顯著增加。慢性免疫性血小板減少癥患者體內(nèi)存在著間充質(zhì)干細胞的功能異常，糖皮質(zhì)激素激素是目前最常見的應用于慢性免疫性血小板減少癥患者治療的藥物[13]，研究發(fā)現(xiàn)其可以調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞的平衡發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[14]，本實驗結(jié)果顯示，與PHA刺激組比較，間充質(zhì)干細胞與cITP患者T細胞共培養(yǎng)組IL-4的表達水平升高，IFN-γ表達量則顯著降低，其效果與地塞米松治療組相似，提示骨髓間充質(zhì)細胞可以調(diào)節(jié)cITP患者的細胞因子的失衡；進一步研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)組以及糖皮質(zhì)激素治療組T-bet/GATA-3比值明顯降低，表明正常人間充質(zhì)干細胞可以逆轉(zhuǎn)cITP患者T細胞兩種轉(zhuǎn)錄因子的失衡，從而對cITP患者產(chǎn)生一定的治療作用。

綜上所述，與糖皮質(zhì)激素效果相似，間充質(zhì)干細胞與cITP患者T細胞共培養(yǎng)后，可以通過調(diào)節(jié)T-bet和GATA的平衡，進而調(diào)節(jié)細胞因子IL-4和IFN-r的平分泌發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，因此，間充質(zhì)干細胞有可能成為一種新型的生物免疫療法應用于臨床上cITP患者的治療。

作者簡介：姜鏵(1972-)，男，博士，副主任醫(yī)師 ，研究方向：血液系統(tǒng)疾病診治。

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