2型糖尿病性勃起功能障礙大鼠模型的建立及氧化應激對海綿體組織內nNOS表達的影響

孔東波，查文良，郭宗華，江波濤

(咸寧市中心醫院泌尿外科，湖北 咸寧 437100)

勃起功能障礙(erectile dysfunction，ED)是指多種原因造成的陰莖海綿體血液充盈不足，致陰莖持續不能達到和/或維持足夠的勃起，以完成并維持滿意的性交，病程超過3個月就可診斷為ED。近年來我國居民生活水平得到顯著的提高，飲食結構和生活方式也發生明顯的改變，因此2型糖尿病患者數量也急劇增加。作為糖尿病嚴重并發癥之一的ED，引起國內外學者廣泛的關注。大約35%～75%糖尿病男性患者患有ED[1]。以往文獻報道，2型糖尿病各種并發癥的發生、發展與氧化應激有著密切的關系，神經型一氧化氮合酶(nNOS)在陰莖勃起的過程中起到重要作用。本研究通過建立2型糖尿病大鼠模型，探討氧化應激與nNOS在2型糖尿病性ED發生發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗藥品、試劑與儀器 兔抗鼠nNOS抗體、山羊抗兔二抗試劑盒購自Sigma公司；鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，Sigma)；阿撲嗎啡(apomorphin，APO，Sigma)；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒購自北京天恩澤有限公司；胰島素放免試劑盒購自上海瑞齊生物科技有限公司。

1.2 實驗動物 10周齡SPF級白色雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，體質量220g左右，購自武漢大學醫學院實驗動物中心，交配實驗證實勃起功能正常。

1.3 建立2型糖尿病大鼠模型與APO實驗檢測勃起功能 實驗開始前40只大鼠適應性喂養1周，隨機選取30只做為實驗組，剩下的10只作為對照組(大鼠未被行特殊處理)。實驗組給予高脂高糖飲食且不限水，半天光照、半天黑暗條件下喂養4周。3d內2次尾靜脈注射STZ，1周稱重后，按照5.0g/kg給每只大鼠用50%葡萄糖水灌胃，測定胰島素抵抗指數。2型糖尿病大鼠造模成功的標準為：空腹血糖>16.7mmol/L且具有胰島素抵抗。糖尿病大鼠造模成功后繼續被給予高脂高糖飲食8周且每周測1次空腹血糖觀察一般狀況。

阿樸嗎啡(APO)試驗：兩組大鼠飼養8周后稱重，將每只大鼠放到透明玻璃箱中，室內保持安靜，燈光調暗至僅夠觀察，適應環境15min，然后在大鼠頸部皮膚下注射阿樸嗎啡100μg/kg，觀察30min，并記錄每組大鼠陰莖勃起次數。陰莖膨大、包皮后退，龜頭充血及末端陰莖露出即為1次陰莖勃起。勃起次數≥1次，認為是勃起實驗陽性。

1.4 標本的處理、分光光度法測定MDA、SOD及Western Blotting技術檢測陰莖組織中nNOS的表達 阿樸嗎啡試驗結束后，繼續禁食不禁水12h，將大鼠處死，立即分離出陰莖組織，用生理鹽水沖洗后，迅速置于-80℃超低溫冰箱中，檢測陰莖海綿體組織中超氧化丙二醛(MDA)、物歧化酶(SOD)的含量和用Western Blotting技術檢測陰莖組織中nNOS的表達情況。

2 結 果

2.1 2型糖尿病性勃起功能障礙大鼠模型建立與APO實驗 實驗組大鼠尾靜脈注射STZ并高脂高糖飲食后開始出現多飲、多食、多尿，形體消瘦。對照組大鼠食欲正常，活動有力。到全部實驗結束時，對照組大鼠未有死亡，實驗組大鼠有25只2型糖尿病造模成功，有6只在實驗期間死于各種糖尿病并發癥。尾靜脈注射STZ，1周后所測空腹血糖、空腹胰島素及計算胰島素抵抗指數見表1。

表1 兩組大鼠空腹血糖、空腹胰島素及計算胰島素抵抗指數

阿樸嗎啡實驗：10只對照組大鼠陰莖都可以勃起，勃起率為100%。最后存活19只2型糖尿病大鼠中，只有7只可以勃起，勃起率為37%。將可以勃起的7只糖尿病大鼠從實驗組剔除。

2.2 分光光度法測定MDA與SOD 結果見表2。

表2 對照組和實驗組大鼠陰莖組織中的MDA、SOD含量

2.3 nNOS在兩組大鼠陰莖海綿體組織內的表達情況 由圖1可知實驗組大鼠陰莖海綿體組織中nNOS的表達量明顯低于對照組大鼠陰莖海綿體組織中的nNOS。

圖1 Western Bloting法檢測大鼠陰莖海綿體組織內nNOS表達量

3 討 論

目前糖尿病的發病率正在快速地升高，應用在治療糖尿病的花費也非常的高昂[2]。在美國有多于800萬糖尿病性ED患者[3]。專家們推測隨著糖尿病發病率的增加，糖尿病性勃起功能障礙的發病率也會大大的增加。在美國每年用在治療勃起功能障礙的直接花費大約4億美元，其中大約1億美元是用于治療糖尿病性勃起功能障礙[3]。藥物治療糖尿病性勃起功能障礙的有效率非常低，并且藥物不能阻止和/或逆轉糖尿病性勃起功能障礙病程的進展。研究對象是1型糖尿病，對于2型糖尿病性勃起功能障礙機制的研究還比較少[4]。更為重要的是目前缺乏對于2型糖尿病勃起功能障礙男性患者長期的觀察研究，用于研究2型糖尿病勃起功能障礙機制的動物模型也是最近幾年來才得到學者們的重視。因為在男性糖尿病患者中非胰島素依賴性2型糖尿病患者占90%～95%。但是絕大多數的基礎實驗研究集中在以1型糖尿病動物模型為研究對象的勃起功能障礙發生機制的研究[5]。迄今為止，大約只有十多個研究是以2型糖尿病動物模型為研究對象。2型糖尿病動物模型的建立大多數選取鼠類，包括肥胖的ZDF大鼠、BBZ/WOR大鼠、OLET大鼠[6]。小鼠模型通常也可以被用來研究，包括高脂飲食的肥胖糖尿病Tsumara Suzuki小鼠、新西蘭肥胖ob/ob與db/db小鼠[7]，其中后兩種小鼠對減肥藥如來普汀缺乏敏感性。這些動物模型與人類2型糖尿病癥狀相似通常同時具有高血糖、胰島素抵抗、高脂血癥、肥胖的特點。但是，這些動物模型中只有少數幾種出現勃起功能障礙并可應用于勃起功能障礙的研究。特別是對陰莖組織內脂肪過多介導的勃起功能障礙機制的基礎研究表明，α-腫瘤壞死因子在勃起功能障礙的發生發展中起到重要的作用[8]。但是這些實驗研究采用的動物模型是昂貴的遺傳性2型糖尿病大鼠模型，這些動物模型有兩大缺點：①價格昂貴不利于大樣本的實驗研究；②不能正常反應自然病程的所有方面特征[9]。我們采用的高脂高糖飲食聯合低劑量注射STZ方法造成的糖尿病性勃起功能障礙大鼠形體消瘦，這點與2型糖尿病性ED患者形體消瘦相似。在全世界范圍內非肥胖性2型糖尿病患者占所有2型糖尿病患者的42%，在我們中國絕大多數都是非肥胖性2型糖尿病患者[10]。

在陰莖勃起過程中NO是起決定作用的神經遞質，而NO合酶是催化 L-精氨酸分解產生NO的關鍵酶。NO合酶是一種含有亞鐵血紅蛋白的合酶，是由兩個亞單位組成的具有催化活性的同源二聚體，分子量約為150000KD。NO合酶是NO合成的限速酶，哺乳動物細胞內有3種亞型的NO合酶：神經型(nNOS)、內皮型(eNOS)和誘導型(iNOS)。在陰莖海綿體內與NO的生成關系最為密切的是nNOS和eNOS。海綿體組織中由nNOS催化合成的NO在陰莖勃起中起著“扳機”作用[11]。當機體受到性刺激時，陰莖組織中nNOS被激活短暫釋放少量的NO引起陰莖脈管系統和海綿竇中平滑肌舒張導致陰莖動脈血流增加、體積膨大而啟動陰莖勃起。血流對陰莖脈管系統和海綿竇血管內皮細胞產生的應切力激活PI3-K/Akt/eNOS信號通路，使eNOS(Ser-1177)位點發生磷酸化，引起NO持續的釋放，從而使陰莖組織內的平滑肌持續的舒張，陰莖達到完全的勃起[12]。

氧化應激損傷是指機體內高活性分子如活性氧簇(ROS)產生過多和/或消除減少而導致的組織損傷。氧化應激產生的自由基可以與DNA、蛋白質和多不飽和脂肪酸作用，造成DNA鏈斷裂和氧化性損傷、蛋白-蛋白交聯、蛋白-DNA交聯及脂質過氧化。此外，自由基也極易與其它物質發生反應形成新的自由基或氧化物。我們的實驗結果發現：與對照組相比，2型糖尿病性勃起功能障礙大鼠陰莖海綿體組織內的MDA含量顯著增高，并且具有統計學意義(P<0.05)；而與對照組相比，2型糖尿病性勃起功能障礙大鼠陰莖海綿體組織內SOD的活性顯著的降低(P<0.05)。這的確說明了糖尿病時陰莖海綿體內ROS顯著增加，機體抗氧化防御能力下降，使兩者原先的平衡被打破，進一步引起勃起功能障礙。

低劑量STZ聯合高脂高糖飲食可造成2型糖尿病動物模型。2型糖尿病可致成年雄性SD大鼠陰莖海綿體組織中MDA含量升高，SOD活性降低，發生氧化應激反應。2型糖尿病使得陰莖海綿體組織發生氧化應激損傷導致nNOS的表達降低可能是引起糖尿病性勃起功能障礙發病的重要病因之一。

[1]McCulloch DK，Campbell IW，Wu FC，et al.The prevalence of diabetic impotence[J].Diabetologia，1980，18(4):279

[2]Hogan P，Dall T，Nikolov P.Economic costs of diabetes in the US in 2002[J].Diabetes Care，2003，26(3):917

[3]Saigal CS，Wessells H，Pace J，et al.Predictors and prevalence of erectile dysfunction in a racially diverse population[J].Arch Intern Med，2006，166(2):207

[4]Chitaley K.Type 1 and type 2 diabetic-erectile dysfunction：same diagnosis (ICD-9)，different disease[J].J Sex Med，2009，3(6 suppl):262

[5] Bacon CG，Hu FB，Giovannucci E，et al.Association of type and duration of diabetes with erectile dysfunction in a large cohort of men[J].Diabetes Care 2002，25(8):1458

[6]Vernet D，Cai L，Garban H，et al.Reduction of penile nitric oxide synthase in diabetic BB/WORdp (type I)and BBZ/WORdp (type II)rats with erectile dysfunction[J].Endocrinology，1995，136(12):5709

[7]Xie D，Odronic SI，Wu F，et al.Mouse model of erectile dysfunction due to diet-induced diabetes mellitus[J].Urology，2007，70(1):196

[8]Carneiro FS，Zemse S，Giachini FR，et al.TNF-alpha infusion impairs corpora cavernosa reactivity[J].J Sex Med，2009，3(6 suppl):311

[9]Gur S，Kadowitz PJ，Hellstrom WJ.A critical appraisal of erectile function in animal models of diabetes mellitus[J].Int J Androl，2009，32(2):93

[10]Brunetti P.The lean patient with type 2 diabetes:characteristics and therapy challenge[J].Int J Clin Pract Suppl，2007，(153):3

[11]Zhang XH，Filippi S，Morelli A，etal.Testosterone restores diabetes-induced erectile dysfunction and sildenafil responsiveness in two distinct animal models of chemical diabetes[J].Sex Med，2006，3(2):253

[12]Hurt KJ，Musicki B，Palese MA，et al.Akt-dependent phosphorylation of endothelial nitric-oxide synthase mediates penile erection[J].Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(6):4061