參附注射液對大鼠腸缺血再灌注損傷和修復的影響

王代宏，王 偉

(咸寧市中心醫院普外科，湖北 咸寧 437100)

腸黏膜缺血-再灌注損傷是創傷、休克后導致多器官功能障礙綜合征的重要病因學基礎及中心環節。細胞異常凋亡是缺血-再灌注期間腸黏膜損傷的主要機制[1]，因此探討腸缺血-再灌注損傷和修復的防治措施非常重要。有研究表明，參附注射液能保持血液動力學的穩定、調整免疫功能、改善組織與器官的微循環[2]。我們通過觀察大鼠腸缺血-再灌注損傷時小腸組織病理學改變、細胞凋亡指數與有絲分裂活性，以探討參附注射液對腸缺血-再灌注損傷與修復時小腸上皮的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 54只雄性健康大鼠，體重200～260g，購自武漢大學醫學院動物實驗中心，動物合格證號：SCXK(鄂)y20090850。術前晚禁食。大鼠被隨機分為3組：對照組(n=6)、腸缺血再灌注組(n=24)和參附處理組(n=24)，后兩組再分為缺血1h組、再灌注1h組、再灌注24h組和再灌注72h組，每組各6只。

1.2 方法 腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉(40mg/kg)，上腹部正中切口進腹，分離出腸系膜上動脈，腸缺血再灌注組和參附處理組用無損傷血管夾阻斷腸系膜上動脈血流1h，再灌注1、24、72h，參附處理組于阻斷前30min經靜脈輸注參附注射液(雅安三九藥液公司，批號111232，速度8ml/(kg·h)，總量20ml/(kg·d)，對照組不阻斷腸系膜上動脈血流，對照組與腸缺血再灌注組于阻斷前30min經靜脈輸注等量生理鹽水，整個實驗過程均面罩給氧。在各個相應時間點上取動物的回腸制成標本待測。

1.3 觀察指標 觀察3組在各個相應時間點的組織病理學改變，測定細胞凋亡指數和有絲分裂活性。

1.3.1 腸黏膜病理學改變 每只大鼠取2cm回腸作標本，固定、脫水、石蠟包埋、切片、HE染色，每個標本腸黏膜組織病理損傷采用Haglund等積分法[3]。小腸絨毛高度采用光學顯微鏡下MPIAS-500多媒彩色病理學分析系統測定。

1.3.2 腸黏膜上皮細胞凋亡指數測定 采用末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記實驗(TUNEL)結合激光共聚焦顯微鏡觀察小腸黏膜上皮細胞凋亡情況(試劑盒購自德國)，由于凋亡細胞染色定位于細胞核呈棕黃色，在顯微鏡下細胞核具有棕黃色顆粒作為凋亡細胞。凋亡指數(apoptosis index，AI)是每張切片隨機取10個高位視野(×400)，每100個細胞中凋亡陽性細胞數。

1.3.3 腸黏膜上皮細胞有絲分裂活性的測定 在HE染色的腸黏膜上皮細胞間觀察有絲分裂相，10個相鄰腸黏膜上皮細胞間具有有絲分裂相的細胞數作為有絲分裂活性指數。

2 結 果

2.1 腸黏膜病理學變化 對照組為正常腸黏膜絨毛，缺血1h組部分腸黏膜絨毛分離和高度降低，對應參附處理組顯示絨毛與腺體輕度受損，上皮下間隙擴大，毛細血管充血；腸灌注1h組絨毛脫落、暴露與分離，腸絨毛高度降低，對應參附處理組顯示上皮和固有層中度分離與少許絨毛脫落，病理學變化明顯好于缺血-再灌注損傷組；再灌注24h后，腸黏膜顯示不規則再生的短絨毛，上皮細胞呈立方形，間質炎性細胞浸潤，絨毛高度明顯降低，而對應參附處理組腸黏膜病理學改變改善明顯；灌注72h兩組腸絨毛高度增加，接近正常腸黏膜絨毛(表1)。

表1 腸黏膜缺血-再灌注損傷后腸黏膜病理學改變

2.2 腸黏膜上皮細胞凋亡指數 對照組顯示腸黏膜絨毛少量凋亡細胞，缺血1h組和再灌注1h組腸黏膜上皮細胞凋亡增加明顯，參附處理組腸黏膜上皮細胞凋亡降低，仍高于對照組。腸灌注24、72h，腸黏膜上皮細胞凋亡降低明顯，與參附處理組比較，這些改變差別沒有統計學意義(見表2)。

表2 腸黏膜上皮細胞凋亡指數與有絲分裂活性的改變

2.3 腸黏膜上皮細胞有絲分裂活性 與對照組及參附處理組比較，缺血1h組和再灌注1h組腸黏膜上皮細胞有絲分裂活性降低明顯，腸灌注24h，腸黏膜上皮細胞有絲分裂活性增加，腸灌注72h后接近正常水平，兩組差別沒有統計學意義(見表2)。

3 討 論

3.1 小腸黏膜缺血-再灌注損傷 小腸黏膜缺血15min即有絨毛頂端上皮細胞損傷，持續5h幾乎整個小腸壁壞死[1]。我們研究發現，缺血1h后腸黏膜絨毛分離，腸灌注1h絨毛明顯脫落、暴露與分離，黏膜屏障損害，絨毛高度與有絲分裂活性降低明顯。目前認為細胞凋亡是組織缺血-再灌注損傷導致細胞死亡的重要方式，在這過程中許多病理改變如凋亡基因、氧自由基、炎性細胞、細胞內和細胞間鈣離子的異常分布與腸黏膜上皮細胞凋亡關系密切[4]。本研究也發現，正常小腸絨毛頂端少量細胞凋亡與小腸上皮細胞生理更新密切，腸缺血1h、再灌注1h后小腸絨毛大量上皮細胞凋亡，與腸黏膜屏障的損害程度密切相關。

3.2 小腸黏膜缺血后的修復 腸上皮細胞凋亡與增殖存在動態平衡，是保證腸黏膜穩定的重要機制[5]。我們實驗證實腸再灌注24h腸黏膜上皮隱窩有絲分裂活性明顯高于再灌注1h，但腸絨毛的結構并沒有完全恢復。腸再灌注72h腸黏膜上皮隱窩有絲分裂活性達到正常水平，結構也接近正常腸絨毛。腸黏膜上皮細胞的修復與基因調節、細胞因子、多肽生長因子以及間質組織與上皮細胞的交互作用密切相關[6]。我們觀察到腸黏膜上皮細胞凋亡和DNA碎裂在小腸黏膜缺血-再灌注1h達到高峰，再灌注24h和72h降低，凋亡細胞開始于絨毛的頂端和隱窩。這證明腸黏膜上皮細胞凋亡與大量增殖、生長失常和細胞老化有關，從而保持腸黏膜結構的穩定。

3.3 參附注射液對腸黏膜缺血再灌注損傷和修復的防治作用和可能機制 參附注射液在防治腸黏膜缺血再灌注損傷方面表現出“多靶作用”的優勢[7]。臨床上廣泛應用于損傷、休克與多器官功能障礙綜合征。我們研究發現，在參附處理組缺血1h、灌注1h腸黏膜病理學改變好于缺血-再灌注損傷組，灌注24、72h，參附注射液的保護作用逐漸減弱，這證實參附注射液能夠減輕腸黏膜缺血再灌注損傷早期腸黏膜上皮細胞的病理學損害。參附處理組腸黏膜上皮細胞凋亡指數低于缺血-再灌注損傷組，說明參附注射液能夠降低腸黏膜上皮細胞凋亡。與缺血-再灌注損傷組比較，在參附處理組缺血1h和灌注1h腸黏膜上皮細胞有絲分裂活性增強，在接下來的腸灌注24h后，兩組腸黏膜上皮細胞有絲分裂活性均明顯增加，到灌注72h達正常水平，這證實參附注射液能夠增強腸黏膜上皮細胞有絲分裂活性，促進細胞的再生及修復。

腸黏膜上皮細胞凋亡在腸黏膜缺血再灌注損傷與修復中起重要作用，有效維持了腸黏膜的穩定。參附注射液能夠減輕腸黏膜缺血再灌注損傷與修復過程中腸黏膜上皮細胞的病理學損害，這種保護作用在早期尤為明顯，其機制可能是參附注射液能夠降低腸黏膜絨毛上皮細胞凋亡、增強上皮細胞有絲分裂活性、促進腸黏膜絨毛上皮細胞的再生及修復。

[1]Coopersmith CM， O'Donnell D， Gordon JI，et al.Bcl-2 inhibits ischemia-reperfusion induced apoptosis in the intestinal epithelium of transgenic mice[J].Am J Physiol，1999，276:G677

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[3]Haglund U，Osterberg J.Local consequences of reperfusion in the gut.Pierce A and Robert T Mathie :Ischemia-Reperfusion Injury[J].Blackwell Science，Oxford UK，1999，23:65

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[6]李云勝，劉克玄，劉家欣，等.大鼠腸缺血再灌注損傷后腸黏膜差異表達蛋白質組的分離與鑒定[J].中華生物醫學工程雜志，2009，15(3):170

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