改良2型糖尿病大鼠模型的構建*

袁 鑫,蔡雪洲,謝 航,丁未堯，蔡 飛**

(1．湖北科技學院藥學院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學院糖尿病心腦血管病變湖北省重點實驗室)

據流行病學資料顯示，1980年至今的糖尿病的患病率為0.7%。WHO預測至2030年，全球的糖尿病患者將達到3.66億，95%的患者為2型糖尿病[1]。糖尿病及其并發癥的發病機制至今尚未完全闡明，隨著發病率的逐漸升高，針對這一病癥的治療藥物篩選越來越受重視，因此建立一個理想且易行的動物模型，對研究該病及其并發癥的發病機制和治療方案有著重要的意義。

有研究報道證實，長期進食高糖高脂飲食能夠加劇胰島功能的減退，在胰島素抵抗狀態下，機體胰島素受體底物明顯減少，葡萄糖轉運功能受損，肝臟中葡萄糖6-磷酸酶增多，致使肝臟糖異生增強，糖原合成減少，影響其機體糖代謝的能力，從而更易誘導出糖耐受的狀態[2]。目前建立糖尿病動物模型的方法較多，如自發性糖尿病動物模型、實驗性糖尿病動物模型和轉基因糖尿病動物模型等[3]。本文針對實驗性2型糖尿病動物模型的構建方案進行了改良，旨在探討采用高脂飼料誘導加低劑量鏈脲佐菌素(STZ)注射，構建簡單、成模率高、死亡率低的2型糖尿病動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級雄性SD大鼠40只，體質量(150±20)g (購自武漢大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(鄂)2014,質量合格證號：42000500003580)。飼養于通風清潔級動物房，標準籠喂養，自由攝食、飲水。室溫24℃，相對濕度40%～70%，室內通風良好，氨濃度<20ppm。12h光照與12h黑暗循環照明。

1.2 主要試劑和儀器設備

1.2.1 主要試劑 STZ、檸檬酸和檸檬酸鈉均購自美國Sigma公司。血糖測試儀(長沙三諾生物傳感技術股份有限公司)；電子天平(長沙湘儀天平儀器設備有限公司)；pH計(瑞士Mettler Toledo公司)。0.22μmol /L微孔濾膜過濾器：(Corning，德國)。

1.2.2 主要溶液的配制 0.1mol/L檸檬酸緩沖液的配制：檸檬酸(FW:210.14)2.1g加入超純水100ml中配成A液，檸檬酸鈉(FW:294.10)2.94 g加入超純水100ml中配成B液，將A、B液按1∶1比例混合，pH計測定pH值，調節pH=4.2～4.5，高壓蒸汽滅菌后置于4℃保存備用。鏈脲佐菌素配制液：STZ溶解在預冷的0.1mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH=4.2～4.5)中，經0.22μmol /L微孔濾膜過濾除菌。錫紙包裹避光，現配現用。

1.2.3 高糖高脂飼料配置 制作時將豬油和白糖用微波爐加熱溶解，配料充分混勻后做成小塊狀冰凍保存，配方見表1。

表1 高糖高脂飼料配方(%)

1.3 試驗方法

1.3.1 大鼠的分組及喂養方案 隨機分為2組：正常組10組，實驗組30只，稱重后各自編號進行分籠飼養，每籠5只，適應性喂養1周后，對實驗組實行為期1月的誘導飼料喂養，正常組給予普通老鼠飼料飼養。所有大鼠都有充足飲水，大鼠置于普通級動物房飼養每兩天更換一次墊料。

實驗組大鼠在誘導飼料喂養4周，體質量達300g左右，禁食(不禁水)10h，一次性腹腔注射低劑量STZ 25mg/kg，正常組給予等體積的檸檬酸鹽緩沖液。STZ溶液在15min內通過腹腔注射入大鼠體內。實驗組在注射STZ溶液后2h內給實驗組大鼠喂10%濃度的白砂糖水溶液，避免實驗組大鼠因低血糖死亡。2h后將白砂糖水換為涼白開水，防止大鼠出現酮癥酸中毒，采用涼白開水的目的是為了防止大鼠成模后抵抗力下降，而因飲水不潔造成感染出現死亡的現象[4，5]。給藥后監測實驗組大鼠在注射STZ后3d的空腹血糖(當血糖≥11．1mmol/L時，視為造模成功)。實驗組大鼠造模成功后將食物配方改用維持飼料進行飼養，涼開水喂養，將實驗組大鼠進行重新分籠，由每籠5只改為每籠3只，由每兩天更換一次墊料改為每天更換一次，墊料的多少根據前一天鼠籠的干濕程度而適量增減。

1.3.2 大鼠空腹血糖測定及葡萄糖耐量試驗(IPGTT) 大鼠體重及血糖值每30d記錄一次。禁食10～12h，尾靜脈采血，采用長沙三諾血糖儀測定其空腹血糖。大鼠喂養4周后， IPGTT實驗采用大鼠腹腔注射葡萄糖溶液(2g/kg)，測定糖負荷后0，15，30，60，90，120min各時間點的血糖值，制作IPGTT的時間-血糖曲線。

1.4 統計學分析 所有實驗結果使用軟件GraphPad Prism 5進行分析。

2 結 果

2.1 IPGTT-GLU變化 實驗組在使用誘導飼料喂養4周后IPGTT-GLU實驗可明顯誘導出胰島素抵抗，實驗組大鼠通過1個月高脂飼料誘導，在30min時血糖表達值最高，隨時間推移出現緩慢下降趨勢，見圖1。

2.2 體重變化 正常組與實驗組大鼠體重對比有明顯差異，正常組大鼠在60d時體重呈上升趨勢，實驗組明顯下降并在90d呈緩慢上升趨勢，見圖2。

2.3 血糖變化 正常組與實驗組大鼠血糖差異明顯，實驗組大鼠血糖值在90d達到最高，正常組血糖穩定，見圖3。

3 討 論

STZ是從鏈霉菌中提取的一種廣譜抗菌藥物，也是實驗動物糖尿病模型的常用誘發劑，可直接使胰島β細胞DNA分子中的特殊位點甲基化，進一步作用于二磷酸腺苷核糖體聚合酶，損傷β細胞[6]，從而使血糖升高。目前文獻中報道的常用誘導方法主要是單一的通過高脂高糖飼料進行誘導，禁食時間長達16h，一次性注射STZ，正常環境飼養，動物死亡率高，長期飼養動物血糖逐漸降低。

本實驗對以往文獻中報道的相關問題進行了摸索總結，為保證給藥后的存活率，需將大鼠適應性飼養一段時間，待大鼠體質量到300g左右時再進行注射。實驗組注射STZ前需禁食物10h(不禁水)，注射STZ(25mg/kg)溶液進行模型構建，誘導飼料和維持飼料交互的方式對大鼠進行喂養。著重每日觀察大鼠的精神狀態，根據大鼠的實際情況對大鼠的飼養環境及墊料進行適當變化，盡可能使大鼠在一個舒適的環境中生存，以達到最高的成模率及生存率。

該造模方案模擬臨床2型糖尿病的發病過程，動物模型具備臨床2型糖尿病的生物化學特點：如血糖增高，體重減輕，糖耐受量改變。通過人為干預有效的避免了實驗大鼠因月齡、飲食、雌雄、體重等原因造成的造模失敗及死亡率高的情況，是一種造模時間短、成模率高、存活周期長的較好造模方案。

[1]Yang W，Lu J，Weng J,et al.China national diabetes and metabolic disorders study group prevalence of diabetes among men and women in China[J].N Eng J Med，2010,362(12)：100

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[5]Li B，Wang HS，Li GG，et al.The role of endoplasmie reticulum stress in the early stage of diabetic retinopathy[J].Aeta Diabetologica，2011，48(2):10

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