射頻消融治療大鼠肝泡狀棘球蚴病及病理改變

桑澤杰，朱帝文，紀衛政，任偉新，顧俊鵬，張海瀟，溫 浩

射頻消融（radiofrequency ablation，RFA）是 20世紀90年代初發展的微創治療肝腫瘤的方法，通過熱能使腫瘤組織發生凝固性壞死。肝癌的RFA治療效果與腫瘤大小相關，對于直徑≤3 cm的小肝癌，其治療效果可與外科手術媲美[1]，近年來認為≤7 cm的病灶都可以經RFA完全消融。RFA具有適應證廣泛、機體創傷小、手術安全性高的特點，有效性和適應證較寬、不良反應及并發癥少，能最大限度地保護剩余肝功能，已廣泛應用于肝癌的局部治療[2]。肝泡狀棘球蚴病（hepatic alveolar echinococcosis，HAE）是一種人獸共患寄生蟲病，由多房棘球蚴絳蟲感染所致，多為肝臟原發病灶，主要分布在我國西北部和西南部地區。該病發病率低，為0.3%～4.8%，某些牧區高達10%，是一種常見的地方病，新疆為該病高發區之一[3]。其生長方式類似腫瘤，呈浸潤性生長，侵犯周圍組織，同時可向遠處轉移，故又稱“蟲癌”[4]。確診該病時大部分患者已失去根治性切除機會，手術切除率僅為20%～40%[5]。目前該病多為手術切除聯合阿苯達唑治療，研究表明在患者生存概率和并發癥發生率方面姑息性手術聯合藥物組與單純藥物組無差異，且姑息性手術聯合藥物治療患者的病情更容易惡化，甚至死亡[6]。本實驗在直視下行RFA治療HAE，探討RFA治療HAE的安全性和有效性，通過天冬氨酸轉氨酶（AST）和丙氨酸轉氨酶（ALT）評估肝功能受損程度，探討RFA對殘余病灶組織泡球蚴存活的影響，對早期微小和難治性HAE治療提供新的選擇。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇2月齡清潔級雄性Wistar大鼠 50只，體重（0.20±0.05）kg（新疆醫科大學實驗動物中心供給），大鼠飼養在清潔環境中。參照文獻制作大鼠HAE的疾病模型[7]。并于接種6個月后用B超篩查HAE種植情況[8]，選擇無鈣化型HAE模型動物。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及處理 取30只病灶直徑（0.75±0.25）cm的HAE模型大鼠，分成對照組（假手術組）10只和實驗組20只。對照組開腹暴露HAE病灶后縫合；實驗組大鼠麻醉后，背部脫毛、分離和暴露HAE病灶，直視下將射頻電極插入肝臟病灶中心，調節功率為50 W，時間2 min。兩組動物分別于術前及術后3、5、7 d剪尾取血，檢測AST和ALT水平。第7天處死全部大鼠，取HAE組織標本，部分置于4%甲醛溶液中固定48 h，石蠟包埋，連續5 μm切片（每份標本5片）、脫蠟、染色后行病理檢測，與肝功能測定結果一并進行綜合分析。

1.2.2 HAE分級 根據泡球蚴的角質層、生發層在光鏡下的病理形態學改變和育囊發育情況分為3級[9]。 0級（基本正常）：泡狀棘球蚴結構基本正常，多數見育囊或芽生結構，育囊內有數量不等的原頭節，鈣顆粒形態正常。Ⅰ級（變性改變）：泡狀棘球蚴結構存在，角質層和生發層可辨認，組織普遍變性腫脹，很少見育囊和原頭節。Ⅱ級（壞死）：泡狀棘球蚴結構失常，生發層細胞核固縮、溶解或消失，育囊與原頭節少見；偶見鈣顆粒，形態模糊；重者有纖維組織增生和炎性細胞浸潤。

1.3 統計學處理

采用SPSS17.0軟件進行統計學分析。組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RFA對肝功能的影響

實驗組AST和ALT在術后第3天達最高值，分別為（193.89±9.31）u/L 和（60.07±2.68）u/L，與對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05）；第5天AST和ALT值逐漸下降，分別為（169.04±7.76）u/L和（41.31±2.18）u/L，與對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05）；第7天兩者均恢復至正常水平，分別為（106.73±5.15）u/L 和（31.57±3.44）u/L，與對照組相比差異均無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 HAE模型大鼠的病理改變

實驗組大鼠在實驗過程中意外死亡1只。RFA術后7 d，實驗組病理變化以Ⅱ級為主（17/19），光鏡下角質層、生發層模糊，部分生發層細胞空泡變、核溶解；Ⅰ級2只，光鏡下可見泡狀棘球蚴結構失常，角質層、生發層普遍變性、分離或斷裂、脫落，皮層變薄，部分結構被破壞（圖1）。

圖1 實驗組病理變化以Ⅱ級（壞死）為主（HE，×200）

2.3 組織病理學改變

肝HAE模型病灶呈浸潤性生長，無包膜，泡球蚴病灶細胞呈巢片狀或假腺樣分布，排列較為緊密，局部紊亂，細胞體積大，形態不規則，胞質嗜雙色性，核大小不一，深染，核染色質粗，核仁明顯。消融治療后，射頻毀損區呈類球形。標本毀損區中央呈灰白色，周邊水腫出血呈暗紅色，與周圍正常組織分界不清（圖2）。

圖2 RFA后中心區為大片不定形壞死組織；周邊見炎性反應帶，其內較多中性粒細胞、淋巴細胞及紅細胞聚集；外圍為殘存的泡球蚴病灶及其邊緣帶組織（HE，×200）

3 討論

RFA機制是射頻電磁波震動引起離子相互摩擦產生熱量；電極針局部組織傳至病灶周圍溫度可達45～50℃，引起組織脫水及蛋白質變性；局部溫度超過70℃時，導致蛋白質凝固性壞死[10-11]。但是，局部溫度超過100℃時，電極針周圍病灶組織出現炭化與氣化，此現象阻礙了熱量傳導。Valley公司的冷循環電極通過熱傳導系統帶走熱量，保持射頻電極局部病灶周圍的相對低溫，減少或避免消融病灶局部組織的氣化和炭化，同時可保證或擴大消融灶的范圍[10，12-13]。 同時，病灶周邊的微血管及組織凝固，使之不能繼續向病灶供血，不僅促進殘存病灶死亡還有利于防止病灶轉移[14]。一直以來，手術切除是HAE僅有的治療方法[15]。而對早期的小病灶HAE，手術治療尚有爭議，主要以姑息性藥物阿苯達唑治療，但由于該藥溶解性較低，且在體內廣泛分布，極大地減低了其生物利用度。近年以RFA為代表的局部治療為肝臟等實性占位病變治療提供了新的選擇。而RFA的出現大大提高了局部治療的療效，有文獻報道RFA治療肝囊性包蟲病的離體動物實驗顯示，RFA 具有良好的效果[16]。 Thanos 等[17]報道術后聯合RFA治療1例復雜肝包蟲囊腫取得滿意療效。

RFA治療HAE僅有個案報道，尚無大量有對照的研究。本實驗RFA后HAE病灶完全壞死率與文獻報道相似[18-19]，RFA灶周邊為炎性反應，細胞間通透性增大，可見大量紅細胞滲出，炎性細胞聚集。術后肝功能檢測表明，RFA治療HAE安全，療效肯定，有強大的促進組織壞死作用。RFA治療HAE有一定優勢，實驗中部分HAE消融模型建立在HAE移植瘤基礎上，對動物肝臟損傷很小，相應的動物耐受力則很強。我們在大鼠肝臟上同時觀察RFA后殘余病灶和RFA治療后局部致熱性損傷引起的良性炎癥反應，模擬人原發性HAE的RFA后殘余病灶，提供了仿真的臨床研究模型，比較適用于原發性HAE的RFA后的病理學研究及療效判定等相關研究。

本實驗定制的灌注型RFA電極借助微量水泵將冷生理鹽水泵入消融病灶組織內部，通過此方式既降低病灶組織周圍區域溫度，減少或避免炭化和氣化的發生，又增加消融病灶組織內的離子數目，增強了離子震動及熱傳導，在不增加功率的情況下擴大病灶消融范圍[10，12-13]。

RFA治療因創傷小、并發癥少、療效確切等優點，已成為最有前景的熱凝固消融方式。RFA治療HAE的目的在于原位滅活泡狀棘球蚴，最小限度地損傷正常肝組織；假手術組AST和ALT水平無明顯變化，而實驗組行RFA后第3天AST和ALT水平明顯升高，第5天仍較正常稍高，可能為RFA引起病灶局部微血管及組織凝固，局部有效血流絕對灌注較少，導致病灶局部細胞缺血缺氧，高能磷酸化合物如ATP減少，Na＋-K＋-ATP泵的酶活性下降，Ca2＋跨膜內流增加，引起ATP分解活躍，為自由基的生成提供底物。同時，內流的Ca2＋還可激活蛋白酶，催化次氧嘌呤的氧化反應，最終生物膜脂質氧化損傷。但在第7天，實驗組AST和ALT趨于正常，表明RFA雖對大鼠肝功能有一定的損傷，但仍可恢復。

實驗組大鼠病灶經RFA后損傷主要以壞死為主（Ⅱ級），但仍有少數Ⅰ級病變，可能與泡球蚴病灶約0.8 cm有關，血供主要來自于門靜脈[20-22]，RFA治療時由門靜脈帶走較多熱量，消融不完全。此外，特殊部位如膈頂、心臟、靠近腸道等部位，也是消融不完全的原因[23-25]。本研究結果提示，開腹直視下RFA在治療大鼠HAE方面有較大的應用潛力，短期內病灶液化壞死明顯，HAE完全滅活，我們認為RFA在治療HAE中可能有重要作用，對于治療微小及難治性HAE，可能是一種選擇，可望為臨床治療HAE提供新的治療方法。

本實驗通過制作大鼠HAE RFA治療模型，初步觀察RFA后短期內病灶的病理學改變及肝功能損害，揭示RFA后殘余病灶的生物學活性改變，為進一步RFA治療早期HAE小病灶及其臨床應用提供理論依據。RFA治療后大鼠泡球蚴病灶周邊微血管的改變、遠期復發轉移及再次治療等問題有待于進一步的研究。

[1]N’Kontchou G，Mahamoudi A，Aout M，et al.Radiofrequency ablation of hepatocellular carcinoma：long-term results and prognostic factors in 235 Western patients with cirrhosis [J].Hepatology，2009，50： 1475-1483.

[2]Kim JW，Shin SS，Kim JK et al.Radiofrequency Ablation combined with trans-catheter arterial chemoembolization for the treatment of single hepatocellular carcinoma of 2 to 5 cm in diameter： comparison with surgical resection [J].Korean J Radiol，2013，14： 626-35.

[3]王成偉，張 林.肝臟泡狀棘球蚴病的CT MRI表現[J].中國現代醫學雜志，2007，20：2536-2538.

[4]Ammann RW，Hirsbrunner R，Cotting J，et al.Recurrence rate after discontinuation of long-term mebendazole therapy in alveolar echinococcosis（preliminary results）[J].Am J Trop Med Hyg，1990，43： 506-515.

[5]Polat KY，Balik AA，Celebi F.Hepatic alveolar echinococcosis：clinical report from an endemic region [J].Can J Surg，2002，45：415-419.

[6]阿依甫汗·阿汗，張日新，張金輝，等.姑息性手術加藥物和單純性藥物治療肝泡狀棘球蚴病的循證醫學效果評價[J].中國現代醫學雜志，2011，21：1868-1872.

[7]張金輝，溫 浩，劉章鎖，等.原發性肝泡球蚴動物模型的建立[J].中國局解手術學雜志，2000： 11-13.

[8]朱帝文，任偉新，顧俊鵬，等.超聲在篩檢大鼠肝泡狀棘球蚴病模型中的應用價值[J].中國醫學影像技術，2009，25：363-365.

[9]陸永綏，李清華，張偉明.臨床檢驗自動化分析儀器標準化操作規程[M].杭州：浙江大學出版社，2006：9-15.

[10]Ni Y，Mulier S，Miao Y，et al.A review of the general aspects of radiofrequency ablation[J].Abdom Imaging，2005，30： 381-400.

[11]Dupuy DE，Goldberg SN.Image-guided radiofrequency tumor ablation： challenges and opportunities-partⅡ[J].J Vasc Interv Radiol，2001，12： 1135-1148.

[12]Mulier S，Ni Y，Miao Y，et al.Size and geometry of hepatic radiofrequency lesions [J].Eur J Surg Oncol，2003，29： 867-878.

[13]Lee JM，Han JK，Kim SH，et al.Bipolar radiofrequency ablation in ex vivo bovine liver with the open-perfused system versus the cooled-wet system[J].Eur Radiol，2005，15： 759-764.

[14]郭俊淵.現代腹部影像診斷學[M].北京：科學出版社，2001：611.

[15]Ammann RW.Improvement of liver resectional therapy by adjuvant chemotherapy in alveolar hydatid disease [J].Swiss Echinococcosis Study Group（SESG）.Parasitol Res，1991，77：290-293.

[16]Lamonaca V，Virga A，Minervini MI，et al.Cystic echinococcosis of the liver and lung treated by radiofrequency thermal ablation：an ex-vivo pilot experimental study in animal models [J].World J Gastroenterol，2009，15： 3232-3239.

[17]Thanos L，Mylona S，Brontzakis P，et al.A complicated postsurgical echinococcosis cyst treated with radiofrequency ablation[J].Cardiovasc Intervent Radiol，2008，31： 215-218.

[18]封 云，佟小強，楊 敏，等.正常動物肝臟的射頻消融實驗[J].中國介入影像與治療學，2005，2： 211-214.

[19]Morimoto M，Sugimori K，Shirato K，et al.Treatment of hepatocellular carcinoma with radiofrequency ablation：radiologichistologic correlation during follow-up periods [J].Hepatology，2002，35：1467-1475.

[20]任偉新，肖湘生.肝泡狀棘球蚴病門脈血供的實驗研究[J].中國介入影像與治療學，2007，4：142-147.

[21]樊玉祥，任偉新，迪理木拉提·巴吾冬，等.DSA評價大鼠肝泡狀棘球蚴病血供 [J].中國介入影像與治療學，2012，09：37-40.

[22]朱帝文，穆 民，任偉新，等.經門靜脈藥物灌注化療栓塞治療大鼠肝泡狀棘球蚴病的電鏡觀察 [J].介入放射學雜志，2013，22： 614-627.

[23]潘 杰，陳紹輝，盧 欣，等.全麻下CT引導下經穿刺射頻消融治療肝內特殊部位的惡性腫瘤 [J].介入放射學雜志，2010，06： 478-481.

[24]彭國文，李曉群.射頻消融及組合方案治療特殊/高危部位肝癌的中遠期療效[J].介入放射學雜志，2013：525-528.

[25]翟 博，李曉燕，劉 晟，等.膈頂部原發性肝癌的射頻消融[J].介入放射學雜志，2009，18： 357-361.