小分子抗體制備技術及臨床應用進展

陳麗娟，張麗華，李 杰，陳永新

自20世紀80年代以來，隨著各種分子生物學技術的發展和抗體基因結構的進一步闡明，DNA重組技術開始廣泛應用于抗體的改造，抗體制備技術已從多克隆抗血清、單克隆抗體發展到基因工程抗體。隨著近年來各種抗體制備相關技術如噬菌體抗體庫技術、核糖體展示技術等的不斷發展，人們可制備各種類型的小分子抗體，如Fab抗體、ScFv抗體、單域抗體等，這些抗體的分子量只有完整抗體的1／6～1／2大小，除具有分子量小，穿透性強，不與Fc受體結合等特點外，還易于在各種表達系統表達及便于操作和大量生產，已成為基因工程抗體家族的主要成員和研究熱點。現對小分子抗體的制備技術及其在臨床醫學和疾病診斷治療等領域應用的研究進展作一綜述。

1 小分子抗體的分類

常見的小分子抗體主要包括Fab（由完整的輕鏈和Fd構成），Fv（由 VH 和 VL 構成），ScFv（單鏈抗體，VH 和 VL 之間由一連接肽連接而成），單域抗體（僅由VH組成），最小識別單位（MRU，由一個CDR組成）以及超變區多肽、雙鏈抗體、三鏈抗體、微型抗體等幾種類型。而目前研究比較多的是單鏈抗體，Fab抗體，單域抗體及雙特異性抗體等。

1．1 單鏈抗體 在DNA水平上用一段適當的寡聚核苷酸作為連接肽（linker）將VH和VL連在一起，使之表達成為一條單一肽鏈，即為單鏈抗體（ScFv）。如ZCH－7－2F9單鏈抗體（ScFv2F9）的構建不僅有利于在大腸桿菌中進行基因重組操作和表達也增加了其穩定性［1］。但有時構建的ScFv其親和力明顯低于親本抗體，并常有聚集的傾向。為改善這一不足，如在構建抗狂犬病毒的單鏈抗體ds－FV57時就在VH和VL之間插入了一個鏈間二硫鍵［2］，這個鏈內二硫鍵遠離互補決定區（CDRS），也不會影響抗原與抗體的結合能力，所以可以廣泛應用，將這一類抗體簡稱為dsFv。單鏈抗體分子量小，對腫瘤的穿透力強，可將其與藥物或同位素、毒素等結合后在腫瘤的靶向治療中發揮獨特的優勢，在疾病的診斷方面具有一定的價值。

1．2 Fab抗體 Fab抗體由一條完整的輕鏈和重鏈Fd段通過一個鏈間二硫鍵連接組成一個異二聚體，分子結構比較穩定，不僅保持了天然抗體分子Fv段的結構，還具有穿透力強、免疫原性低，可與多種藥物及放射性同位素偶聯，用作藥物的導向治療載體和顯影等特點。目前已用作實驗室研究工具，如構建噬菌體Fab抗體庫，鑒定抗體可變區間基因的功能活性，以及觀察蛋白酶抑制抗體的不同機制等［3］。在此基礎上，制備的單鏈Fab片段（scFab）可進一步加強功能性分子的生成［4］。但Fab抗體因其雙鏈結構在原核細胞的表達受到一定的限制，還因蛋白分子在穿過內膜和折疊時效率低下，影響其分泌性表達量，且僅有1個抗原結合位點，與抗原的親和力低，在腫瘤診斷方面沒有dsFv應用廣泛。

1．3 單域抗體 由于發現有些抗體的VH區也可與抗原結合，且保持了完整抗體的特異性，稱其為單域抗體（single domain antibody）。單域抗體只有完整IgG分子的1／12，相較于其他抗體分子量更小也更容易進入細胞。而近幾年隨著抗體制備技術的不斷發展，單域抗體不僅在微生物中高表達，也能保持一定的可溶性和穩定性，所以比較適合用噬菌體展示或核糖體展示等技術制備［5］，而且制備操作簡便，可用來構建效應功能和結合親和性的抗體，具有一定的應用發展前景。

1．4 雙特異性抗體（bispecific antibody，BsAb） 雙特異性抗體是含有2種特異性抗原結合位點的人工抗體，一個位點可與靶細胞表面抗原結合，另一個位點則可與載荷物如毒素、酶、細胞因子、放射毒素等耦合，能在靶細胞和功能分子（細胞）之間架起橋梁，激發具有導向性的免疫反應，現已成為抗體工程領域的熱點，在腫瘤的免疫治療中具有廣闊的應用前景［6，7］。

2 小分子抗體的制備

當前，常用于生產小分子抗體片段的表達系統通常有大腸桿菌（E．coli）表達系統、酵母表達系統、昆蟲細胞表達系統和哺乳動物細胞表達系統4種。它們的表達成本大致是依次遞增的，但翻譯后加工的精確性和準確度卻是依次遞減的。因為不同的小分子抗體其一級結構、理化性質和生物活性是各不相同的，所以在選擇表達系統時要根據所要表達的小分子抗體的類型、性質、目的產物的表達量和純度的要求等來選擇。

2．1 大腸桿菌（E．coli）表達系統 E．coli表達系統是基因表達技術中發展最早，應用比較廣泛的經典表達系統，經常用來表達Fab、ScFv等小分子抗體。E．coli生長速度快培養周期短，目的蛋白表達水平高，遺傳背景也比較清楚，而且進行抗體工程研究時花費較少，所以目前被廣泛使用。但是由于大腸桿菌本身的蛋白翻譯后修飾加工體系相當不夠完善，因此在表達外源蛋白時不能對表達產物進行修飾加工，影響了外源蛋白的活性，而且表達的外源蛋白也容易被宿主菌釋放的蛋白酶降解，所以要選擇合適的宿主菌，這些都限制了其的應用［8］。

2．2 酵母表達系統 酵母表達系統，既具有微生物的特點，又作為真核生物彌補了原核表達系統缺乏蛋白質翻譯后加工的缺陷。目前常用的酵母表達系統有啤酒酵母（Sacharomyces cervisiae）和巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）等。啤酒酵母安全性高，但表達的蛋白質常超糖基化，分泌能力不強，較難實現高密度發酵。近年常用的酵母表達系統主要是畢赤酵母系統，它具有發酵密度高，分泌外源產物能力強，能翻譯后修飾和糖基化修飾等優勢，迄今為止已經成功表達了幾百種外源蛋白［9］。人們利用畢赤酵母系統成功的從1L酵母培養基上清液中純化得到56mg的人類BAFF scFv－Fc抗體，不但解決了大腸桿菌表達抗體時不能分泌，復性后生物活性差以及產率低等缺陷，也消除了細菌表達的抗體在臨床應用時可能存在毒性的風險［10］。但畢赤酵母分子生物學的研究基礎差，發酵周期長，發酵時需添加甲醇都限制了對其的使用。

2．3 昆蟲細胞表達系統 昆蟲細胞表達系統是一類廣泛應用的真核表達系統，和大多數高等真核生物相似具有翻譯后修飾、加工以及轉移外源蛋白的能力。主要包括桿狀病毒表達系統、穩定轉化系統兩種。而桿狀病毒表達系統是目前國內外較為推崇的真核表達系統之一，主要分成兩大類，一類是用于表達單個外源基因的載體，另一類是多元表達載體，用于插入并表達2個或多個外源基因。應用這一系統表達的產物具有糖基化，磷酸化等修飾，接近于天然蛋白［11］。Furuta等［12］利用桿狀病毒感染夜蛾成功表達出具有活性的Fab抗體。但是桿狀病毒系統無法進行連續性高表達，糖基化方式與哺乳動物存在一定差異，其功能基因組學的研究仍然比較薄弱，有關病毒晚期的高表達和調控機制等仍不夠明了，所以這些問題都限制了其的應用，這還需要我們不斷探索可對其進行部分改進以達到理想的效果。

2．4 哺乳動物細胞表達系統 與其他系統相比，哺乳動物細胞表達系統的優勢在于能夠指導蛋白質的正確折疊，提供復雜的N型糖基化和準確的O型糖基化等多種翻譯后加工功能，因而表達產物在分子結構、理化性質和生物學功能方面接近天然的高等生物蛋白質分子。目前常用于表達蛋白的哺乳動物細胞宿主有 CHO、COS、HeLa細胞、HEK293、NSO 等，其中CHO細胞是近年來研究最多應用相對廣泛的細胞系，可用于表達多種外源蛋白。有報道利用重組的CHO細胞表達外源蛋白時產量能達到10 g／L，這可用于重組蛋白的工業化生產［13］。另外COS細胞系可用來做較為快速的測定，非洲綠猴腎的Vero細胞系可用來生產流感疫苗。所以目的不同選擇表達的哺乳動物細胞也不同，但哺乳動物細胞對培養環境十分敏感，營養和生長因子缺乏、缺氧、病毒感染、機械攪動以及培養壓力的增加等很多因素都能誘導細胞凋亡，所以利用該系統表達時需要大規模培養動物細胞，成本較高，而且在篩選過程中比較費時也比較容易污染，這些都限制了其的應用，目前已有很多學者開始關注哺乳動物細胞的篩選研究［14］。

3 小分子抗體在臨床上的應用

隨著生物工程技術的發展，小分子抗體的制備越來越容易，而且小分子抗體的一系列特性決定了其在醫學領域的許多方面將具有很大的應用潛力，主要表現在疾病診斷、腫瘤性疾病治療及抗感染等方面的應用。

3．1 在疾病診斷方面的應用 隨著抗體技術的不斷發展，放射性標記抗體的應用越來越廣泛應用于腫瘤影像和診斷中。將針對腫瘤相關抗原的特異性抗體用放射性核素標記后注入人體，隨血液流達腫瘤組織，與腫瘤的相關抗原結合，從而獲得腫瘤的陽性顯像圖稱為放射免疫顯像。而小分子抗體所具有的分子量小，組織穿透強，清楚快等特點決定其更適合應用于放射免疫顯像，應用于腫瘤的診斷。Douguchi等［15］運用噬菌體展示技術篩選出與人小細胞肺癌細胞株H889結合的scFv，不僅可用于小細胞肺癌的早期診斷，還可以根據膜定位位置對小細胞肺癌進行影像學定位，具有很大的臨床價值。而99m锝－標記的抗CEA Fab抗體片段應用于臨床影像學定位已經通過美國FDA認證。目前有些研究可將一些小分子抗體片段制備成某種試劑盒或芯片用于臨床檢測。Matsumoto等［16］通過制備抗觸珠蛋白的Fab抗體檢測試劑盒來檢測胰腺癌，發現通過此檢測胰腺癌IV期的陽性率顯著高于其他臨床分期。Even－Desrumeaux等［17］還將篩選出的單域抗體制成抗體芯片，Mazzucchelli等［18］利用磁性納米技術將重組單域蛋白A標記，均可用于檢測某些腫瘤標志物。

3．2 在腫瘤導向治療中的應用 惡性腫瘤的導向治療，是指應用親腫瘤特異性載體與殺傷腫瘤細胞的活性物質（化療藥物、毒素、放射性核素等）相連接，將活性物質選擇性送到腫瘤部位，定向的殺傷腫瘤細胞的方法。在腫瘤治療中，雙特異性抗體可針對低水平的腫瘤相關抗原，將活性物質選擇性送到腫瘤細胞。Wang等［19］制備的抗G22×I50雙特異性抗體通過誘導TH1型細胞因子分泌及激活CD8T細胞，抑制CD4（＋）CD25（＋）T細胞的表達，可探索鼻咽癌中抗癌抗生素免疫機制。Kellner等［20］制備的抗 CD19×CD16 雙特異性抗體，可增強B淋巴瘤細胞的抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用（ADCC）。Tuscano 等［21］構建抗 CD20×CD22 雙特異性抗體可用于治療淋巴細胞瘤。此外，也可將制備的人源小分子抗體直接用于腫瘤的診斷治療。

3．3 小分子抗體的抗感染作用 目前人類最常利用疫苗和抗生素來預防和治療感染性疾病，但對于SARS、AIDS等疾病，目前還未發現有效的治療方法，但可選用抗體治療作為首選方案。如Shen等［22］已成功構建了針對特異性細胞株的Fab噬菌體抗體庫。Hartono等［23］則研究比較了HK20Fab和D5Fab分別與HIV－1gp41結合的親和力以抑制病毒和細胞膜的結合，這些對于SARS的預防、診斷和治療將奠定一定的基礎。對于一些其他的感染性疾病，Chen等［24］制備的Fab091抗體已經證實可以中和狂犬病病毒，它可以和單克隆抗體一樣在未來的研究中作為接觸狂病病毒的預防措施。

此外，小分子抗體還可用作酶標抗體、用于臨床診斷和腫瘤影像分析等。將單鏈抗體同酶、蛋白質的基因連在一起，構建成復合功能抗體基因，通過成熟表達和純化技術直接分離出用于臨床診斷的酶標抗體，使診斷更為方便、快速、更適合于臨床應用。

4 展 望

近年來，有關小分子抗體的研究進展迅速，在基礎理論研究和臨床應用方面都取得了一定的效果。目前通過基因工程抗體技術制備的小分子抗體在疾病診斷、腫瘤性疾病治療、抗感染以及放射顯像等方面均得到了廣泛的應用。但是，制備的小分子抗體在產量、親和性、穩定性等方面尚未達到臨床應用的要求，抗體的免疫原性仍然是臨床治療的主要障礙，如何得到足夠數量及質量的小分子抗體在技術上仍是一個未解決的問題。因此，如何提高其表達產量，增強其穩定性和特異性，提高臨床應用的有效性及可靠性，仍需做大量深入的研究和臨床試驗。相信隨著抗體技術的不斷發展和基礎研究的不斷深入，小分子抗體在臨床疾病診治中的應用將會更廣泛。

［1］ Ning BT，Tang YM，Cao J，et al．Construction and expression of prokaryotic vector of single chain antibody derived from a new clone of anti－CD14 antibody ZCH－7－2F9［J］．Zhejiang Da Xue Xue Bao，2008，37（1）：51－9．

［2］ Duan Y，Gu TJ，Jiang CL，et al．A novel disulfide－stabilized single－chain variable antibody fragment against rabies virus G protein with enhanced in vivo neutralizing potency［J］．Mol Immunol，2012，51（2）：188－96．

［3］ Yan Wu，Charles Eigenbrot，Wei－Ching Liang，et al．Structural insight into district mechanisms of protease inhibition by antibodies［J］．PNAS，2007，104（50）：19784－19789．

［4］ Hust M，Jostock T，Menzel C，et al．Single chain Fab（scFab）fragment［J］．BMC Biotechnology，2007，7（14）：1472－6750．

［5］ Harmsen MM，De Haard HJ．Properties production and applications of camelid single－domain antibody fragments［J］．Appl Microbiol Biotechnol，2007，77（1）：13－22．

［6］ Booy EP，Johar D，Maddika S．Monoclonal and bispecific antibodies as novel therapeutics［J］．Arch Immunol Ther Exp（Warsz），2006，54（2）：85－101．

［7］ Sarkar S，Tang XL，Das D，et al．A bispecific antibody based assay shows potential for detecting tuberculosis in resource constrained laboratory settings［J］．PLoS One，2012，7（2）：e32340．

［8］ DENG Chun－mei，GE Yu－qiang，LIU L，et al．Progress on the expression system of exogenous gene［J］．Progression Modern Biomedicine，2010，10（19）：3744－3746．

［9］ Hang HF，Ye XH，Guo MJ，et al．A simple fermentation strategy for high－level production of recombinant phytase by Pichia Pastoris using glucoseas the growth substrate［J］．Enzyme and Microbialogy Technology，2009，44（4）：185－188

［10］ Ren F，Li BC，Zhang NN，et al．Expression，purification and characterization of anti－BAFF antibody secreted from the yeast Pichia pastoris［J］．Biotechnology Letters，2008，30（6）：1075－1080

［11］ Olczak M，Olczak T．Comparison of different signal peptides for protein secretion in nonlytic insect cell system［J］．Anal Biochem，2006，359（1）：45－53．

［12］ Furuta T，Ogawa T，Katsuda，et al．Efficient production of an antibody Fab fragment using the baculovirus－insect cell system［J］．J Biosci Bioeng，2010，110（5）：577－81．

［13］ Kim JY，Kim YG，Lee GM．CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins：current state and further potential［J］．Appl Microbiol Biotechnol，2012，93（3）：917－30．

［14］ Browne SM，Al－Rubeai M．Selection methods for high－producing mammalian cell lines［J］．Trends Biotechnol，2007，25（4）：425－32．

［15］ Douguchi J，Hashiguchi A，Sakamoto M．Construction of human monoclonal single－chain Fv antibodies against small－cell lung cancer by phage display libraries derived from cell－immunized SCID mice engrafted with human peripheral blood lymphocytes［J］．Proteomics Clin Appl，2009，3（11）：1265－1272．

［16］ Matsumoto H，Shinzaki S，Narisada M，et al．Clinical application of a lectin－antibody ELISA to measure fucosylated haptoglobin in sera of patients with pancreatic cancer［J］．Clin Chem Lab Med，2010，48（4）：505－512．

［17］ Even－Desrumeaux K，Baty D，Chames P．Strong and oriented immobilization of single domain antibodies from crude bacterial lysates for high－throughput compatible cost－effective antibody array generation［J］．Mol Biosyst，2010，6（11）：2241－2248．

［18］ Mazzucchelli S，Colombo M，De Palma C，et al．Single－domain protein A－engineered magnetic nanoparticles： toward a universal strategy to site－specific labeling of antibodies for targeted detection of tumor cells［J］．ACS Nano，2010，4（10）：5693－5702．

［19］ Wang J，Li Y，Li Yi，et al．In vitro anti－tumor immune mechanism of nasopharyngeal carcinoma bispecific anti－idiotype antibody［J］．Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban，2010，35（8）：777－783．

［20］ Kellner C，Bruenke J，Horner H，et al．Heterodimeric bispecific antibody－derivatives against CD19 and CD16 induce effective antibody－dependent cellular cytotoxicity against B－lymphoid tumor cells［J］．Cancer Lett，2011，303（2）：128－139．

［21］ Tuscano JM，Ma Y，Martin SM，et al．The Bs20x22 anti－CD20－CD22 bispecific antibody has more lymphomacidal activity than do the parent antibodies alone［J］．Cancer Immunol Immunother，2011，60（6）：771－80．

［22］ Shen YM，Yang XC，Dong NZ，et al．Generation，screening and preliminary identification of specific Fab phage antibody library against Daudi cell strain［J］．Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi，2009，25（2）：150－4．

［23］ Hartono YD，Lazim R，Yip YM，et al．Computational study of bindings of HK20 Fab and D5 Fab to HIV－1gp41［J］．Bioorg Med Chem Lett，2012，22（4）：1695－700．

［24］ Chen LI，Feng ZHANG，Hong LIN，et al．Generation and characterization of the humanneutralizing antibody fragment Fab091 against rabies virus［J］．Acta Pharmacologica Sinica，2011，32（3）：329－337．