甲磺酸伊馬替尼增加順鉑對耐藥卵巢癌細胞作用的研究

張 闊，陳 燕

0 引言

卵巢癌是死亡率最高的女性生殖系統腫瘤，其中上皮性癌占卵巢癌的90%，因為卵巢深居盆腔，常因發現晚、播散快而嚴重影響患者的預后。目前，卵巢癌的治療方案為手術聯合化療。腫瘤減滅術后和不能耐受手術的患者都需要通過化療來提高患者的生存率，鉑類的初始化療對絕大部分患者有效，但這些患者會出現復發和耐藥，因此，對化療藥物耐藥成為治療中最棘手的問題。以鉑類為代表的臨床一線化療藥有消化道反應和腎毒性，并且隨著濃度的增大，毒性反應更加明顯。因此，尋找治療效果好，毒副作用小，并能提高卵巢癌對化療藥物敏感性的藥物和治療方案迫在眉睫[1]。分子靶向藥物是利用腫瘤細胞與正常細胞之間分子生物學上的差異(包括基因、酶、信號轉導等不同特性)，抑制腫瘤細胞增殖，最后使其死亡。近年研究發現，分子靶向治療藥物與傳統藥物相比，毒副作用小，無須最大耐受劑量即可獲得較好的臨床療效，也可以為一些耐藥腫瘤的治療提供新的方案，受到廣泛關注。甲磺酸伊馬替尼(Imatinib mesylate)是分子靶向藥物的一種，屬于酪氨酸激酶受體抑制劑。有研究表明，該藥物特異性靶向3種受體，分別是 Bcr-Abl酪氨酸激酶、血小板源性生長因子受體(PDGFR)、干細胞因子(c-Kit)，可以通過阻止酪氨酸激酶受體自身的磷酸化，影響細胞信號轉導，破壞細胞周期進程，從而影響腫瘤細胞的增殖、分化與凋亡[2]。本研究以其中的耐藥卵巢癌細胞系SKOV3/DDP為研究對象，從細胞增殖、凋亡等方面探討甲磺酸伊馬替尼對卵巢癌耐藥細胞體外培養的影響，以及其對細胞耐藥的逆轉作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 SKOV3細胞株(人卵巢漿液性囊腺癌細胞株)由中國醫學科學院腫瘤醫院腫瘤研究所提供；甲磺酸伊馬替尼，大連美侖生物技術有限公司；順鉑(DDP)，山東羅欣藥業有限公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、RNA酶、胰蛋白酶，Sigma公司；PRMI-1640培養基，GIBCO公司；胎牛血清，杭州四季青生物制品公司；AnnexinV-EGFP 細胞凋亡檢測試劑盒，聯科生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 SKOV3細胞株在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素RPMI-1640培養基中，37 ℃、5%CO2混合氣體的培養箱中培養，細胞換液為24～48 h，待細胞鋪滿瓶底80%～90%時，0.25%胰酶消化傳代。取對數生長期細胞進行實驗，采用順鉑中等濃度、間歇作用方法建立SKOV3/DDP細胞株。

1.2.2 MTT法檢測不同濃度的甲磺酸伊馬替尼、DDP單用藥以及聯合用藥對人卵巢癌耐順鉑細胞株SKOV3/DDP的增殖抑制情況 MTT法測定：取對數生長期的SKOV3/DDP細胞，胰酶進行消化，制成單細胞懸液，進行細胞計數，按照母孔1×104個/200 μL的細胞數接種于96孔板中的細胞分別培養24 h后，倒置像差顯微鏡下觀察，選擇細胞貼壁生長狀態良好的進行試驗。藥物處理組根據藥物不同分為以下3組：甲磺酸伊馬替尼組，終濃度分為1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μmol/L；DDP組，終濃度為5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0 mg/L；聯合組，終濃度甲磺酸伊馬替尼5.0 μmol/L分別與DDP 5.0、10.0、20.0 mg/L聯用，兩藥合用的比例為1∶1。加藥后繼續培養。每個濃度設4個平行復孔，設調零孔為空白對照組(OD值為0)。甲磺酸伊馬替尼單藥作用24、48、72 h不同的時間點，DDP單藥組以及聯合用藥組作用48 h。終止培養，避光操作下，每孔加入配好的5 g/L的MTT溶液20 μL，37 ℃孵箱內避光孵育4 h，吸棄培養基終止培養。每孔加入DMSO 150 μL，室溫下震蕩器低速震蕩15 min。在酶標儀上選擇波長為595 nm，測定細胞的吸光度(OD)值，實驗重復3次。

計算出SKOV3/DDP的耐藥指數以及甲磺酸伊馬替尼、DDP單藥及聯合用藥對SKOV3/DDP細胞株的生長抑制率及IC50值、DDP的耐藥逆轉倍數。公式：(1)細胞生長抑制率=[1-(用藥組OD值-調零孔OD值)/(無藥組OD值-調零孔OD值)]×100%；(2)IC50=lg-1[Xm-i(ΣP-0.5)]；(3)耐藥指數=SKOV3/DDP的IC50/SKOV3的IC50。

1.2.3 流式細胞儀測定細胞凋亡率 取對數生長期的SKOV3/DDP細胞，調整細胞濃度為1×106/mL接種于25 cm2培養瓶中，在37 ℃、5%CO2培育箱中培養24 h后換液。實驗組分3組：單用DDP組，濃度5 mg/L；單用甲磺酸伊馬替尼組，濃度5 μmol/L；聯合用藥組終濃度DDP 10 mg/L和甲磺酸伊馬替尼5 μmol/L；給藥24 h后收集細胞，離心、PBS洗滌，加入結合緩沖液(Binding buffer)懸浮細胞，加入annexinV-FITC 5 μL輕輕混勻，室溫避光孵育，10 min后1 000 r離心5 min，棄上清，加入annexinV-FITC的結合緩沖液190 μL輕輕重懸細胞，加入10 μL碘化丙啶(PI)，冰浴避光放置。流式細胞儀檢測細胞早期凋亡情況。

2 實驗結果

2.1 通過誘導耐藥建立SKOV3/DDP 細胞株，計算出DDP對于SKOV3/DDP細胞及SKOV3細胞的IC50值分別為(39.57±0.98)mg/L和(9.81±0.07)mg/L，其耐藥指數約為4.03。

2.2 采用MTT法檢測甲磺酸伊馬替尼、DDP單藥及聯合用藥時對SKOV3/DDP細胞生長的影響

2.2.1 MTT法檢測出不同藥物濃度的甲磺酸伊馬替尼作用于SKOV3/DDP細胞呈現出不同程度的細胞生長抑制作用，隨藥物濃度的增高、作用時間的延長對細胞的增殖抑制作用增強，甲磺酸伊馬替尼在5.0 μmol/L作用48 h細胞生長抑制率約為30%，故選用此藥物濃度組作為后續實驗的藥物濃度。

表1 甲磺酸伊馬替尼作用于SKOV3/DDP細胞不同作用時間生長抑制率變化

2.2.2 甲磺酸伊馬替尼與DDP兩藥聯合應用對SKOV3/DDP細胞增殖的影響 依據DDP單藥對SKOV3/DDP作用的結果，選擇對細胞生長抑制率小于50%的3個DDP濃度：5、10、20 mg/L，依據表1選擇甲磺酸伊馬替尼劑量濃度為5.0 μmol/L，二者聯合作用于SKOV3/DDP細胞48 h，計算生長抑制率。由表2可見，兩藥聯合用藥組對細胞生長抑制率分別為(38.63±1.31)%、(51.55±1.20)%、(66.54±1.23)%，明顯高于DDP單用藥組的(8.30±0.85)%、(16.68±1.69)%、(30.83±1.78)%，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。由此計算出兩藥合用后的IC50=39.57±0.13，顯著高于單用順鉑的9.57±0.13，兩組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，DDP的藥物敏感性增加4.13倍，見表3。

表2 甲磺酸伊馬替尼與不同濃度DDP聯合作用于SKOV3/DDP細胞的生長抑制率

表3 甲磺酸伊馬替尼與DDP聯合對SKOV3/DDP細胞的影響

2.3 流式細胞儀檢測甲磺酸伊馬替尼、DDP單獨及聯合應用對SKOV3/DDP凋亡的影響 由表4可以看出，對照組、DDP單用藥組、甲磺酸伊馬替尼單用藥組的早期凋亡率分別為0.63%、1.25%、4.57%，各單獨用藥組與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)，聯合用藥組的凋亡率為12.31%，明顯較其他單獨用藥組增高，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，說明甲磺酸伊馬替尼可通過誘導耐藥細胞的凋亡從而增強對DDP的敏感性。

表4 甲磺酸伊馬替尼、DDP單獨及聯合應用對細胞凋亡的影響

3 討論

卵巢癌在女性生殖道腫瘤的發病率中居第3位，但死亡率最高，傳統的治療方法為在腫瘤細胞減滅術的基礎上聯合藥物(鉑類和紫杉醇為主)化療，但最終大多患者會復發。復發后存活時間一般少于3 年[3]。一方面由于70%的患者在確診時已經處于晚期，另一方面由于化療耐藥，致使預后更差。近年來發現，卵巢癌患者常常伴有外周血小板增多，而且血小板增多預示著不良結局[4]，提示抗血小板治療可能是一項有效的治療措施。血小板增多導致血小板衍生因子(PDGF)釋放增多。而PDGF 受體(PDGFR)是腫瘤進展和轉移的重要因素，其過表達與腫瘤的耐藥有關[5]。首先，卵巢腫瘤存在一種旁分泌通路，能增加PDGF釋放[6]，并且發現卵巢癌可檢測到PDGFR的高水平表達[7]。這種旁分泌方式PDGFR的表達以及表達量的高低是一些腫瘤細胞增殖的限速步驟[8]，PDGFR表達越高，腫瘤細胞增殖越快。并且PDGF和PDGFR的結合及信號通路的激活可增加腫瘤基質的組織間液體壓(Interstitial fluid pressure，IFP)[9]，從而阻礙抗腫瘤藥物有效運輸到腫瘤，減少了腫瘤組織對藥物的攝取，從而使腫瘤細胞逃逸被殺或死亡[10]，導致腫瘤的耐藥。PDGFR抑制劑可正常化IFP，從而增加抗腫瘤藥物的療效。

分子靶向藥物—甲磺酸伊馬替尼是一種小分子酪氨酸激酶抑制劑，可以靶向PDGFR，此藥以細胞信號傳導的特異分子為靶點，通過競爭結合ATP位點，特異地阻止酪氨酸激酶受體自身磷酸化，影響腫瘤細胞的增殖、分化和凋亡[11]。甲磺酸伊馬替尼開始用于治療慢性髓性白血病(CML)，后來用于胃腸道腫瘤的治療，效果顯著[12]。近幾年應用于小細胞肺癌、皮膚癌、神經膠質瘤、乳腺癌等方面的研究較多[13]，國外學者在卵巢癌方面也進行了較多的研究，結果發現，對至少表達1種伊馬替尼靶向受體c-kit、c-abl、PDGFR的鉑類耐藥和紫杉醇耐藥的復發卵巢癌患者單一應用伊馬替尼治療，這些患者都能較好地耐受伊馬替尼，但并沒有明顯的臨床療效[14-15]。本實驗將甲磺酸伊馬替尼及順鉑聯用，觀察其對卵巢癌耐藥細胞系SKOV3/DDP的增殖抑制作用、誘導凋亡作用以及對DDP耐藥的逆轉作用。研究表明，甲磺酸伊馬替尼單獨應用，增殖抑制率隨著各自濃度及時間的增加而增加，各組與對照組之間差異顯著；與DDP聯合應用，各組與單獨用藥組相比，差異有統計學意義，且甲磺酸伊馬替尼可以逆轉卵巢癌細胞對DDP耐藥。流式細胞儀檢測細胞凋亡率結果顯示：兩藥聯合組的細胞凋亡率明顯高于單藥組，說明甲磺酸伊馬替尼與順鉑具有協同作用，能促進細胞凋亡，增加對DDP的敏感性。

綜上所述，本實驗采用聯合用藥的方法進行實驗，發現PDGFR抑制劑—甲磺酸伊馬替尼作為新一代抗腫瘤藥，能有效抑制卵巢癌細胞的增殖，同時能夠在一定程度上逆轉腫瘤細胞對順鉑的耐藥性。為臨床卵巢癌的化療提供了新的參考方法。甲磺酸伊馬替尼還可以靶向c-kit、c-abl兩種受體，通過除PDGFR以外的其他途徑發揮作用，有待于其他實驗進行進一步的探索。

參考文獻：

[1] 溫灝,吳小華.復發性卵巢癌研究現狀及治療決策[J].中國實用婦科與產科雜志,2012,28(3):192-196.

[2] 孫宇輝,王蕾,鄭建華,等.格列衛對卵巢癌細胞COC1增殖及血管形成的影響[J].中國實用婦科與產科雜志,2007,23(12):932-934.

[3] 邱彩虹,邱麗華.復發性卵巢癌治療新進展[J].現代婦產科進展,2012,21(1):64-66.

[4] Raungkaewmanee S,Tangjitgamol S,Manusirivithaya S,et al.Platelet to lymphocytera-tio as a prognostic factor for epithelial ovarian cancer[J].Gynecol Oncol,2012,23(4):265-273.

[5] Burger RA.Overview of anti-argiogenic agents in development for ovarian cancer[J].Gynecologic Oncology,2011,121(1):230-238.

[6] Madsen CV,Steffensen KD,Olsen DA,et al.Serum platelet-derived growth factor and fibroblast growth factor in patients with benign and malignant ovarian tumors[J].Anticancer Reader,2012,32(9):3817-3825.

[7] 易村犍,馬丁.C-Kit、PDGFRA的表達與卵巢漿液性癌順鉑耐藥的臨床研究[J].腫瘤防治研究,2008,35(11):805-807.

[8] 陳旭升,孫丹.PDGF和PDGFR與腫瘤的關系及其靶向治療研究進展[J].中國腫瘤臨床,2012,39(15):1134-1137.

[9] 李代洪,艾俊濤,謝欣,等.血小板衍生生長因子受體(PDGFR)抑制劑的研究進展[J].腫瘤藥學,2013,3(1):2-6.

[10]趙亞娟,富建華,孫梅.谷氨酰胺影響膿毒癥大鼠腦內PDGF及其受體表達的研究[J].中國當代兒科雜志,2010,12(12):967-971.

[11]鄭方英,魏永強,孫海燕,等.伊馬替尼治療慢性嗜酸性粒細胞白血病1例并文獻復習[J].中華內科雜志,2010,49(11):974-976.

[12]丁倩倩,陳勤奮.甲磺酸伊馬替尼的臨床應用[J].上海醫藥,2013,34(3):5-9.

[13]宋耕,軒菡,王年飛,等.甲磺酸伊馬替尼的臨床應用研究[J].中華臨床醫師雜志(電子版),2011,5(24):7348-7350.

[14]Schilder RJ,Sill MW,Lee RB,et al.PhaseⅡ evaluation of imatinib mesylate in the treatment of recurrent or persistent epithelial ovarian or primary peritoneal carcinoma:a Gynecologic Oncology Group Study[J].J Clin Oncol,2008,26(20):3418-3425.

[15]Safra T,Andreopoulou E,Levinson B,et al.Weekly paclitaxel with intermittent imatinib mesylate(Gleevec):tolerance and activity in Recurrent epithelial ovarian cancer[J].Anticancer Res,2010,30(1):3243-3247.