碘化鈉注射液細菌內毒素檢查方法的研究

趙 昕，賀康洪，趙文軍，高 錦

0 引言

碘化鈉注射液為軍隊醫院常用制劑，用于腎臟、尿道、膀胱及膽道造影，收載于《中國人民解放軍醫療機構制劑規范》[1]。該制劑按細菌內毒素檢查法指導原則[2]，屬于應建立家兔熱原法或細菌內毒素檢查法的品種，但原質量標準未做規定。家兔法檢查熱原，成本高、操作復雜，結果易受操作人員、試驗動物等因素影響，而鱟試劑法檢查注射劑的內毒素具有靈敏度高、操作簡便、快速等特點。為保證藥品質量，降低使用風險，提高用藥安全性。本文參照2010年版中國藥典附錄細菌內毒素檢查法[3]及文獻[4-6]，建立了鱟試劑方法檢查碘化鈉注射液中的細菌內毒素。

1 藥品與試劑

碘化鈉注射液(規格：20 mL∶碘化鈉2.5 g、硫代硫酸鈉0.002 g、碳酸氫鈉0.1 g，批號：130724-1、130724-2、130724-3，來源：廣州軍區某醫院)；鱟試劑(以下簡稱TAL。規格：0.1 mL，靈敏度：0.25 EU/mL。批號：1309110，生產廠家：湛江博康海洋生物有限公司；批號：1307232，生產廠家：湛江安度斯生物有限公司)；細菌內毒素工作標準品(以下簡稱WSE，中國食品藥品檢定研究院，效價：100 EU/支，批號：150601-201176)；細菌內毒素檢查用水(以下簡稱BET水，湛江安度斯生物有限公司，規格：50 mL，批號：1212260)。

2 方法與結果

2.1 細菌內毒素限值(L)的確定 細菌內毒素限值L=K/M，式中K為人最大可接受的細菌內毒素劑量，注射劑為5 EU/(kg·h)；M為人用的最大供試品劑量，根據《中國人民解放軍醫療機構制劑規范》和本品說明書，得知碘化鈉注射液一次最大用量為50 mL，即 M=50 mL/(60 kg·h)，K為按給藥途徑，人用每公斤體重每小時可接受的內毒素最大劑量，注射劑為5 EU/(kg·h)，按公式計算得碘化鈉注射液的內毒素限值L=6 EU/mL，為嚴格標準、便于計算，最終確定限值為5 EU/mL。

2.2 鱟試劑靈敏度復核實驗 按照2010年版中國藥典細菌內毒素檢查法規定，進行鱟試劑的標示靈敏度復核，結果見表1。

表1 鱟試劑靈敏度復核(EU/mL)

2個廠家的鱟試劑經細菌內毒素工作標準品檢查λC在0.5～2.0 λ之間，符合標準規定，可用于試驗。

2.3 干擾試驗預試驗

2.3.1 供試品最大有效稀釋倍數(MVD)的計算 計算公式為MVD=cL/λ，其中L為碘化鈉注射液的細菌內毒素限值5 EU/mL，λ為鱟試劑靈敏度，c為供試品溶液的濃度，當L以EU/mL表示時，則c=1.0 mL/mL。目前市售鱟試劑靈敏度λ通常在0.5～0.03 EU/mL，則碘化鈉注射液的對應最大有效稀釋倍數分別為：MVDλ0.5=10倍；MVDλ 0.25=20倍；MVDλ0.125=40倍；MVDλ0.06=80倍；MVDλ 0.03=160倍。

2.3.2 實驗操作 將碘化鈉注射液用BET水分別稀釋為10、20、40、80、160倍稀釋液，將此系列濃度溶液記為NPC (Negative product control)。另平行制備系列濃度的供試液，并使10、20、40、80、160倍稀釋液的供試液中均含有2 λ濃度的細菌內毒素，將此系列溶液記為PPC(Positive product control)。用來自2個廠家靈敏度均為0.25 EU/mL的鱟試劑，分別與上述PPC和NPC兩種溶液進行反應，每一濃度重復兩管，并設陽性對照(Positive control)和陰性對照(Negative control)，分別記為PC和NC，混勻后封口，置37 ℃恒溫容器中反應60 min，結果見表2。

表2 碘化鈉注射液干擾預試驗

干擾試驗預試驗結果表明，用2個廠家靈敏度均為0.25 EU/mL的鱟試劑分別對3批碘化鈉注射液行細菌內毒素試驗，結果碘化鈉注射液的10、20、40、80、160倍稀釋液均無干擾。

2.4 正式干擾試驗 為了最終確認是否存在抑制因素的影響，進行正式干擾試驗。取3批碘化鈉注射液用BET水分別稀釋為20倍稀釋液，用該20倍稀釋液和BET水分別將WSE稀釋為含內毒素0.5(2 λ)、0.25(λ)、0.125(0.5 λ)、0.06 (0.25 λ) EU/mL的溶液，與2個廠家靈敏度為0.25 EU/mL的鱟試劑反應，每一濃度重復4管，并設陰性對照，按2010年版中國藥典細菌內毒素檢查供試品干擾試驗項進行實驗，結果見表3。

表3 碘化鈉注射液的干擾試驗(EU/mL)

正式干擾試驗結果表明，將3批次碘化鈉注射液稀釋20倍，用2個廠家靈敏度均為0.25 EU/mL的鱟試劑進行試驗，結果ES均在0.5～2.0 λ，Et均在0.5～2.0 ES范圍內，符合藥典規定，確認供試液對檢查無干擾影響。

2.5 樣品細菌內毒素檢查 按2010年版中國藥典細菌內毒素檢查法，將3批次碘化鈉注射液(用BET水配成20倍稀釋液)，用2個廠家靈敏度λ均為0.25 EU/mL的鱟試劑，按《中國藥典》(二部)附錄細菌內毒素檢查法檢查，結果見表4。

表4 碘化鈉注射液細菌內毒素檢查結果

3 討論

3.1 碘化鈉注射液pH值范圍為7.0～9.0，符合細菌內毒素檢查供試液pH值要求標準，不干擾凝膠反應，無需調節可直接取供試品用BET水稀釋后檢查。

3.2 將碘化鈉注射液配制成10、20、40、80、160倍稀釋液，與2個廠家靈敏度為0.25 EU/mL的鱟試劑反應均無干擾。正式干擾試驗，將樣品稀釋20倍，用2個廠家靈敏度為0.25 EU/mL的鱟試劑進行試驗，結果ES均在0.5～2.0 λ，Et均在0.5～2.0 ES范圍內，確認無干擾影響。對3批次碘化鈉注射液分別依法檢查，結果均符合規定。

3.3 取本品，依法檢查(《中國藥典》2010年版附錄細菌內毒素檢查法)，每1 mL碘化鈉注射液中含內毒素應<5 EU/mL。

參考文獻：

[1] 中國人民解放軍總后勤部衛生部.中國人民解放軍醫療機構制劑規范[S].北京:人民軍醫出版社,2002:313-314.

[2] 中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規程[S].中國醫藥科技出版社,2010:310-325.

[3] 國家藥典委員會.中國藥典2010年版(二部)[S].北京:中國醫藥科技出版社,2010:附錄99-102.

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[5] 付聰,高錦,嵇揚,等.甲硫酸新斯的明注射液細菌內毒素檢查方法的研究[J].藥物分析雜志,2008,28(7):1141-1143.

[6] 羅麗萍,王宗春,郭咸希.鱟試劑方法檢測丙泊酚注射液中細菌內毒素的可行性研究[J].湖北中醫藥大學學報,2011,13(3):235-236.