硫化氫聯合亞低溫對肢體缺血再灌注后大鼠心肌損傷的影響

常國江，劉 濤*，劉志成，章以杰，林 俊，田苗苗，宋曉麗，王 彬

0 引言

肢體缺血再灌注在臨床中較為常見，如斷肢再植及骨科中長時間應用止血帶等，隨著肢體缺血時間的延長，除造成肢體自身的缺血再灌注損傷，還可通過血流轉移到遠隔組織器官如心臟，造成一種間接損傷[1]，因此，如何減輕肢體缺血再灌注遠隔器官的損傷，是臨床急需解決的難題。內質網應激反應(ERS)是細胞對內外環境變化的一種適應性反應，有助于細胞和生命個體的存活；然而，應激過度可引起細胞凋亡，導致疾病。研究顯示，內質網應激反應參與肢體缺血再灌注所致心肌損傷的病理過程[2]。亞低溫是保護缺血器官最有效的方法之一[3-6]。研究顯示，亞低溫治療可有效減少心搏驟停及心肺復蘇對心肌的損傷，降低心肌耗氧量，改善心功能[7]。硫化氫(H2S)作為第三種氣體信號分子，在心血管系統中的研究價值倍受關注。研究顯示，H2S可明顯減輕急性缺血所致的心肌損傷，改善心功能，起到心肌保護作用[8]。但H2S聯合亞低溫對肢體缺血再灌注大鼠心肌細胞內質網應激反應的影響尚無相關報道，本研究擬評價H2S聯合亞低溫對肢體缺血再灌注后大鼠心肌損傷的影響。

1 資料與方法

1.1 分組 健康雄性Wistar大鼠60只(青島大學醫學院實驗動物中心提供)，體重260～300 g，采用隨機數字表法，將其隨機分為5組(n=12)：假手術組(S組)、肢體缺血再灌注組(IR組)、硫氫化鈉組+IR組(H組)、亞低溫組+IR組(M組)和硫氫化鈉聯合亞低溫+IR組(HM組)。

1.2 方法 參照文獻[9]提供的方法制備肢體缺血再灌注動物模型：以橡皮止血帶綁扎雙后肢根部造成肢體缺血3 h，之后松開止血帶使肢體血流再灌注3 h，應用激光多普勒(PriFlux 5001型，Perimed)監測血流被阻斷為缺血成功標志。S組動物給予同樣的麻醉操作，只是用彈力橡皮帶環繞大鼠雙后肢，但不結扎。IR組動物使雙后肢缺血3 h后再灌注3 h。H組和HM組動物于再灌注前10 min腹腔注射NaHS(28 μmol/kg)，其余組注射等容量生理鹽水，而M組和HM組于雙下肢缺血后將大鼠置于冰袋上行體表降溫，使直腸溫于15 min內降至32～33 ℃，并維持3 h；其余組采用白熾燈維持直腸溫36～37 ℃。再灌注3 h，腹腔注射2%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉下，開胸分離并切左心室心肌組織，PBS清洗，以40 g/L多聚甲醛固定，石蠟包埋。

取固定的心肌組織，石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察心肌組織形態學變化情況。

TUNEL細胞凋亡按試劑盒說明書用TUNEL原位法測定凋亡指數。細胞核呈棕褐色或棕黃色顆粒且具備凋亡細胞形態學特征判定為凋亡細胞。Image.Pro Plus v 5.1圖像分析軟件自動選取最有意義的5個視野，每個視野計算陽性細胞所占全部細胞的百分數，最后計算均值，獲得凋亡細胞的百分率，用凋亡指數表示。凋亡指數(%)=(凋亡細胞核計數/總細胞核計數)×100%。

Western blot法測定葡萄糖調節蛋白(GRP78)和半胱氨酸蛋白水解酶(Caspase-12)蛋白表達，取-80 ℃凍存心肌標本加入裂解液中，剪碎后移入1.5 mL EP 管中，4 ℃ 12 000 r/min離心25 min，取上清液進行蛋白定量。SDS-PAGE電泳，濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V，半干法將蛋白質轉移到PVDF膜上，恒壓電泳95 V，室溫1 h，4 ℃孵育過夜，按0.1 mL/cm2膜面積加入1∶500一抗，雜交2 h，封閉液漂洗后按0.1 mL/cm2膜面積加入1∶500二抗，搖床雜交2 h，漂洗后加顯色劑，避光顯色2～5 min，條帶出現，終止反應。以β-actin作為內參，進行比較。采用吸光度掃描分析軟件Quantity one(Bio Rad公司，美國)測定每條帶的吸光度值。將相對吸光度值作為統計學分析的原始數據，去除蛋白不均衡降解造成的誤差。

2 結果

2.1 光鏡下心肌組織形態學變化 光鏡下S組心肌纖維排列整齊，細胞核均勻一致，紋理清晰；IR組心肌細胞腫脹、變性，細胞質紅染，細胞核減少，可見壞死纖維斷裂，纖維間隙增寬，周圍炎性細胞浸潤和紅細胞滲出；H組和M組心肌纖維排列較整齊，間隙減小，細胞輕度腫脹；HM組心肌纖維排列基本恢復正常，細胞邊界清晰，排列規則，稍顯疏松。見圖1。

2.2 大鼠心肌組織凋亡指數GRP78和Caspase-12蛋白表達比較 與S組比較，IR組、H組、M組和HM組心肌細胞凋亡指數升高，GRP78和Caspase-12蛋白表達上調(P<0.05)；與IR組比較，H組、M組和HM組心肌細胞凋亡指數降低，GRP78和Caspase-12蛋白表達下調(P<0.05)；與NaHS組和M組比較，HM組心肌細胞凋亡指數降低，GRP78和Caspase-12蛋白表達下調(P<0.05)；NaHS組和M組的心肌細胞凋亡指數、GRP78和Caspase-12蛋白表達比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表l。

圖1 肢體缺血再灌注后大鼠心肌組織形態學變化的光鏡觀察(HE，×200)

表1各組大鼠心肌組織凋亡指數、GRP78和Caspase-12的蛋白表達比較(n=12)

注：*與S組比較，P<0.05；#與IR組比較，P<0.05；△與HM組比較，P<0.05

3 討論

本研究參照文獻[9]采用橡皮帶環繞結扎大鼠雙后肢3 h，再灌注3 h的方法建立大鼠肢體缺血再灌注模型。光鏡下IR組心肌細胞腫脹、變性，細胞質紅染，細胞核減少，可見壞死纖維斷裂，纖維間隙增寬，周圍炎性細胞浸潤和紅細胞滲出，提示肢體缺血再灌注誘發心肌損傷模型制備成功。

本研究參照文獻[10]選擇腹腔注射NaHS(28 μmol/kg)。參照文獻[11]采用體表降溫的方法使大鼠直腸溫于再灌注開始15 min內降至32～33 ℃，并維持3 h。本研究結果表明，H2S聯合亞低溫可減輕肢體缺血再灌注大鼠心肌細胞損傷，且保護作用強于兩者單獨應用。

GRP78是內質網分子伴侶，對內質網內環境極度敏感，很多能引起內質網應激變化的因素都能直接或間接引起GRP78表達的改變，如高血糖、高血壓、氧化應激、炎癥等因素都可引發其蛋白大量釋放[12]。Caspase-12僅存在于內質網膜上，是以酶原的形式位于內質網的細胞質面，適度的內質網應激，有利于細胞內鈣和蛋白質加工等穩態恢復正常，增強細胞耐受應激刺激的能力；持續而嚴重的內質網應激，觸發內質網相關性細胞凋亡，造成細胞損傷，因此，Caspase-12是內質網應激所致凋亡途徑中的關鍵凋亡蛋白[13-14]。本研究選用GRP78和Caspase-12作為反映內質網應激反應的指標，結果表明，H2S聯合亞低溫可通過下調心肌細胞GRP78和Caspase-12蛋白表達，降低心肌細胞凋亡指數，減輕大鼠肢體缺血再灌注心肌損傷。亞低溫下調心肌細胞GRP78和Caspase-12蛋白表達的機制可能是：肢體缺血再灌注時，ATP合成減少致使離子轉運功能障礙、大量自由基的產生及Ca2+穩態破壞等均可導致新合成的蛋白質蛋白組裝折疊抑制[15]，啟動內質網應激反應。未折疊蛋白聚集于內質網腔內致使GRP78優先與內質網腔內未折疊蛋白結合，從而與跨膜蛋白PERK、IRE1和ATF6解離，激活下游的信號通路，即通過激活生長停止和DNA損傷誘導基因153和Caspase-12等引起細胞凋亡[16]。GRP78表達水平上調可抑制與PERK、IRE1和ATF6的解離，從而抑制以上3個通路的信號轉導，從而減少細胞凋亡[17]。H2S減輕肢體缺血再灌注后大鼠心肌損傷，可能與以下幾個方面有關：①通過興奮KATP通道[18]。H2S是目前所知的唯一的內源性氣體性的平滑肌KATP通道開放劑，可使K+外流增加，心肌細胞膜超極化，縮短動作電位時程，從而影響電壓門控式Ca2+通道，使其活性減低，故Ca2+內流減少，細胞內Ca2+超載降低，減輕缺血缺氧時心肌細胞的損傷[19]。②H2S也可以直接抑制血管平滑肌上的電壓門控式Ca2+通道，降低細胞內Ca2+超載。③通過激活蛋白激酶C及絲裂素活化蛋白酶系統而發揮抗炎癥抗氧化應激的保護作用[20]。是否還有其他機制有待進一步研究。

綜上所述，H2S聯合亞低溫可減輕肢體缺血再灌注后大鼠心肌損傷，其機制與下調心肌細胞GRP78和Caspase-12蛋白表達、減輕內質網應激反應有關。

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