氯沙坦對大鼠心肌缺血后心臟ACE2蛋白表達的影響

常建梅，崔貞玉，韓素霞，郭李平

0 引言

心肌缺血(Ischemic cardiomyopathy,ICM)具有高發病率、高病死率，嚴重危害著人類健康，已成為危害人類健康的主要疾病之一。世界衛生組織估計，到2020年，全世界因冠心病所致死亡人數將高達1 110萬人[1]。近年來，我國冠心病的發病率增高，且呈年輕化趨勢。心肌缺血隨著病情的發生發展最終發生心絞痛、心肌梗死、心律失常和心功能下降，嚴重持久的心肌缺血可致心肌梗死，甚至伴發梗死后惡性心律失常，有導致猝死的風險。本實驗旨在通過驗證氯沙坦對大鼠心肌缺血后ACE2表達的影響，探討氯沙坦改善大鼠心肌缺血預后的新的機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象 SPF級健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，體重220～240 g(新疆醫科大學實驗動物中心提供)。

1.2 主要材料及儀器 氯沙坦(默沙東制藥有限公司，科素亞)；小動物呼吸機(成都泰盟科技有限公司)；電子顯微鏡(上海蔡司光學儀器國際貿易有限公司)；高速低溫離心機(德國Thermo Fhisher)；PB303-N型電子精密天平(德國Thermo Fhisher)；LD4-2型離心機(北京醫用離心機廠)；粉碎勻漿機(美國Bio-Rad)；RIPA裂解液(北京百泰克生物技術有限公司)；PMSF(武漢博士德生物有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司)；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)(北京百泰克生物技術有限公司)；電泳膠(美國NUPAGE)；NC膜(北京中杉金橋)；蛋白預染Marker(北京中杉金橋，分子量19～118 KD)。XJ-75S脫色搖床(北京生物儀器公司)；蛋白電泳轉膜儀(美國Bio-Rad)；Power WaveX340型全自動酶標儀(美國Bio-TEK)；NU-6832E型低溫冰箱(德國Thermo Fhisher)；90-1型磁力雙向攪拌器(德國Thermo Fhisher)；SH-100型凝膠圖像分析儀(美國Bio-Rad)。

1.3 動物模型的建立及標本的采集 建立心肌缺血動物模型：大鼠腹腔麻醉后，用6號可吸收線在距左心耳2～3 mm處部分結扎冠狀動脈，使其狹窄；假手術組只在相同位置造成損傷但不結扎冠狀動脈。

將心肌缺血模型術后24 h存活的42只大鼠隨機分為7組：假手術組(sham，n=6)；14 d模型組(14 d mod，n=6)；28 d模型組(28 d mod，n=6)；14 d小劑量氯沙坦干預組[14 d losa lo，10 mg/(kg·d)，n=6]，14 d大劑量氯沙坦干預組[14 d losa hi，30 mg/(kg·d)，n=6]；28 d小劑量氯沙坦干預組[28 d losa lo，10 mg/(kg·d)，n=6]，28 d大劑量氯沙坦干預組[28 d losa hi，30 mg/(kg·d)，n=6]。小劑量氯沙坦按10 mg/(kg·d)灌胃給藥，大劑量氯沙坦組按30 mg/(kg·d)灌胃給藥，假手術組及模型組給予等量生理鹽水灌胃，各組動物灌胃總容量均為200 g<2 mL。

標本的采集：大鼠腹腔麻醉后，打開胸腔，迅速取出心臟，置于冰上預冷的生理鹽水中洗去血液，濾紙吸干水分。切取左心室心肌缺血區域一分為二，一部分組織置于4%多聚甲醛中，HE染色觀察其心肌缺血后的病理變化，另一部分組織保存于-80 ℃冰箱中。

1.4 ACE2蛋白表達 Western blotting法檢測ACE2蛋白的表達：蛋白裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白含量，定量后各組取45 μg蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳1.5 h，0.35 mA恒流轉膜5 h，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉，分別用ACE2抗體(1∶1 000，92 KD，兔抗)、β-acting抗體(1∶200，47 KD，兔抗)4 ℃過夜孵育，0.05% TBST洗膜3次，每次5 min，對應二抗孵育2 h，0.05%TBST洗膜3次，每次5 min。底物DAB呈色法顯色。各蛋白表達水平經全能型凝膠成像分析儀檢測分析其吸光度值(A值)，并以與內參的比值作為半定量指標進行各組間的比較。

2 結果

2.1 心肌細胞光鏡下結構 HE染色光鏡下可見，假手術組心肌細胞內細胞核清晰可見，肌原纖維清晰，排列整齊，橫紋清楚，間質纖維無增生。模型組心肌細胞胞質不均勻紅染或呈不規則粗顆粒狀，間質水腫，中性粒細胞浸潤明顯，心內膜下心肌細胞彌漫性空泡樣變性，尚可見完整細胞核，隨術后時間的延長心肌細胞萎縮明顯；藥物干預組光鏡下可見胞質均勻紅染，間質水腫、中性粒細胞浸潤均較模型組減輕，細胞核完整，未見心肌細胞空泡樣變性，呈藥物劑量依賴性；以4周大劑量組改善最明顯，炎癥范圍及心肌細胞萎縮面積均較其他組減小。見圖1～圖8。

細胞核清晰可見，肌原纖維清晰，間質纖維無增生

心肌細胞萎縮，空泡變性，炎細胞浸潤

心肌細胞萎縮，炎細胞浸潤

細胞將減少，萎縮改變，炎細胞浸潤

細胞核清晰可見，肌原纖維清晰，間質纖維無增生

心肌細胞萎縮 心臟瓣膜軟骨化，炎細胞浸潤

心肌細胞萎縮，心瓣膜軟骨化生，炎細胞浸潤

心肌細胞萎縮，萎縮范圍比其他組減少

2.2 心肌細胞ACE2蛋白表達的結果 Mod組的ACE2表達高于sham組(P<0.01)，且在1個月內呈時間依賴性；氯沙坦組ACE2的表達明顯高于Mod組，呈劑量依賴性。即隨著用藥時間逐漸延長、劑量逐漸增加，ACE2蛋白表達逐漸增多。見圖9、圖10。

圖9 各組大鼠左室心肌ACE2與β-acting的蛋白印跡圖

圖10 各組大鼠左室心肌ACE2與β-acting的比值

3 討論

ARB類藥物是冠心病治療中可以降低死亡率、改善預后的藥物之一，可以延緩或抑制心室重構。

本實驗結果中：模型組大鼠缺血心肌組織中ACE2蛋白表達量較假手術組升高(P<0.01)，呈時間依賴性；氯沙坦進一步增加了ACE2蛋白質的表達量，呈劑量依賴性。即隨著用藥時間延長、劑量加大，ACE2蛋白表達量增高越明顯。模型組的ACE2蛋白表達較假手術組高可能是心肌缺血缺氧狀態下RAS激活，ACE水平升高使AngⅡ水平增高，反饋性地引起ACE2的升高。而氯沙坦組ACE2表達的增高提示氯沙坦干預時間越長，心肌缺血大鼠心肌組織中ACE2蛋白的表達量越高，越能改善大鼠缺血心肌的缺血狀態。以往研究表明，RAS的過度激活在高血壓和心室重構的發生、發展過程中發揮著重要的作用[2-3]。本實驗結果也提示ACE2可能通過抑制RAS系統其他成員的過度激活來發揮其改善心肌缺血狀態的作用。ACE2是Ang1-7的主要催化酶，Ang1-7具有擴張血管、降低血壓、利尿、抑制心肌細胞肥大、抑制血管平滑肌細胞和心臟成纖維細胞增殖等作用[4-6]，并可有效拮抗AngⅡ的生物學效應。生物體在生理狀態下即存在一種自我平衡功能，血管緊張素家族成員內部之間也不例外，AngⅠ分別在ACE和ACE2的作用下可以水解產生2種多肽：AngⅡ、Ang1-7，而它們的生理作用完全相反，且達成新的平衡，這種平衡對病理狀況下抑制機體血管重構及心肌重塑有著重要的臨床意義。

ACE2在心肌組織中高度表達，進一步驗證了這一新的RAS成員在心血管疾病病理生理中的重要作用。ACE2對心臟的保護作用已有眾多研究證實，有研究者發現，ARB類藥物可增加組織中ACE2的含量，使Ang1-7的水平升高，并認為ARB類藥物增加ACE2的表達，使ACE2產物增加擴血管、改善微循環、抑制血管內皮細胞增生等治療效應[7-8]。以上研究均與本研究結果相一致。

血管緊張素受體阻斷劑氯沙坦，通過競爭性地結合AT1R，使AngⅡ不能與其第一受體結合，增加了AngⅡ與AT2R結合的幾率而促進AngⅡ與AT2結合，擴張血管，從而改善缺血區微循環和逆轉心血管重構的生物功能[7]。本實驗結果提示，氯沙坦也可以通過增強缺血心肌組織中ACE2的表達來改善心肌的缺血狀態。推測氯沙坦是ACE2 表達上調的主要原因，即ARB阻斷了AngⅡ與其主要受體AT1R結合，促使AngⅡ與其受體AT2R結合的幾率增加，發揮生物效應，同時，游離AngⅡ也是ACE2的主要作用底物，從而反饋性地增加ACE2的表達。目前，本實驗結果無法對此假設提供確切的證據，尚需進一步的研究來證實以上推斷。

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