環介導等溫擴增技術用于消化道和呼吸道病毒檢測的研究進展＊

李文桂 綜述，陳雅棠 審校

（重慶醫科大學附屬第一醫院傳染病寄生蟲病研究所 400016）

消化道病毒包括腸道病毒、肝炎病毒和急性胃腸炎病毒等，可分別引起肝炎、急性胃腸炎和手足口病等疾病，呼吸道病毒是呼吸性疾病的一種病原體。據報道90%以上急性呼吸道感染是由呼吸道病毒引起的。在收集到的消化道和呼吸道標本中檢測到相應病毒是診斷這類疾病的金標準，但通常陽性率較低，需要花費大量的物力和人力等資源；隨后人們利用免疫學方法檢測這些病毒刺激機體產生的循環抗原或循環抗體，盡管敏感性較高，但存在較多的假陽性；接著人們采用PCR方法檢測這些病毒，敏感性和特異性有了較大的提高，但昂貴的PCR儀購置限制了它的廣泛應用，研制新的病毒檢測技術已迫在眉睫。

Notomi等［1］針對一段200bp左右的靶基因保守區域的6個特異序列設計4條引物，即上游內部引物（FIP）、下游內部引物（BIP）、上游外部引物（F3）和下游外部引物（B3），利用一種具有鏈置換反應的DNA聚合酶和2對設計引物，對靶序列上的6個特異序列進行核酸擴增，在65℃的等溫條件下反應1h即可將靶序列DNA擴增109～1010倍，產生肉眼可見的白色焦磷酸鎂沉淀，該技術命名為環介導等溫擴增技術（loop－media－ted isothermal amplification，LAMP）。為了提高擴增效率，Nagamine等［2］設計了上游環狀引物（FLP）和下游環狀引物（BLP）。這對環引物可加快反應速度，在30～45min即可實現目的基因的擴增。LAMP技術具有較高的敏感性、較強的特異性，不需昂貴儀器，使用簡捷、花費時間短，可目測判定結果等許多優點，可用于臨床微生物的快速診斷，在各級實驗室具有廣闊的前景。隨后LAMP檢測消化道和呼吸道病毒的研究在國內外迅速開展起來，并有了許多報道，本文就這些報道展開綜述。

1 消化道病毒LAMP檢測

1.1 腸道病毒 人腸道病毒71型（human enterovirus 71，HEV71）和口足疫病毒（foot－and mouth disease virus，FMDV）均是常見的腸道病毒，可分別引起人的手足口病和家畜的口蹄疫。Nie等［3］針對HEV71的VP1基因設計3對引物進行RTLAMP，發現HEV71反應管為陽性，而ECHO病毒對照為陰性，其檢測該病毒的敏感性為每管0.04TCID50；將其用于25例HEV71患者糞樣的檢測，發現其陽性率為100%。李坤等［4］針對HEV71的VP2基因設計2對引物進行RT－LAMP，發現HEV71反應管為陽性，而柯薩奇病毒A16型對照為陰性，其檢測HEV71的敏感性為100copy／mL；將其用于41份咽拭子標本的檢測，發現其陽性率為65.9%（27／41），與熒光定量PCR相當。

Dukes等［5］針對FMDV的3DRNA聚合酶基因序列設計3對引物進行RT－PCR，發現FMDV反應管為陽性，而豬水庖病毒、豬皰疹病毒、圣米格爾海獅病毒、牛杯狀病毒、馬鼻病毒A和牛鼻病毒等6種病毒對照均為陰性，其檢測FMDV的敏感性為每管10copy，與實時熒光RT－PCR相當；將其用于98例患者標本的檢測，發現其陽性率為82.7%（81／98），而RTPCR為79.6%（78／98）。秦智鋒等［6］采用3D－RT－LAMP檢測證實FMDV的0型和亞洲Ⅰ型反應管為陽性，而豬水庖病毒、藍耳病病毒和豬水泡性口炎病毒對照為陰性；將其用于檢測8份確診的口蹄疫臨床標本均可獲得陽性結果。

1.2 肝炎病毒

1.2.1 乙型肝炎病毒（hepatitis virus B，HBV） HBV是乙型肝炎的病原體。楊勁等［7］針對HBV的S區設計3對引物進行LAMP，發現30份HBV反應管為陽性，其檢測HBV的敏感性為40copy／mL。李青雅等［8］用S－LAMP檢測發現20份HBV反應管為陽性，而10份鴨HBV對照為陰性。Cai等［9］針對HBV的pre－s／S區設計3對引物進行LAMP檢測發現HBV反應管為陽性，而HCV對照為陰性，其檢測HBV的敏感性為210copy／mL；將其用于402份HBV患者血樣的檢測，發現其陽性率為73.4%（295／402）。

1.2.2 甲型肝炎病毒（hepatitis virus A，HAV） HAV是甲型肝炎的病原體。Yoneyama等［10］針對HAV的5′－未翻譯區序列設計3對引物進行RT－LAMP，發現HAV反應管為陽性，而脊髓灰質炎病毒、諾如病毒和HEV對照為陰性，其檢測HAV的敏感性為0.6FFU／μL，而RT－PCR為0.5FFU／μL；將其用于5例HAV患者糞樣的檢測，發現其陽性率為100%（5／5），與 RT－PCR相當。

1.2.3 丙型肝炎病毒（hepatitis virus C，HCV） HCV是丙型肝炎的病原體。李啟明等［11］針對HCV的5′－未翻譯區序列設計3對引物進行RT－LAMP，發現 HCV反應管為陽性，而HIV、HBV和流感病毒對照為陰性，其檢測HCV的敏感性為每管100copy；將其用于60份HCV患者血樣的檢測，發現其陽性率為98%（59／60），而 RT－PCR為100%（60／60）。

1.2.4 小鼠肝炎病毒（mouse hepatitis virus，MHV） MHV是小鼠肝炎的病原體。袁文等［12］針對 MHV的核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，NP）編碼基因設計3對引物進行LAMP，發現MHV反應管為陽性，而小鼠腦脊髓炎病毒、漢坦病毒和犬冠狀病毒對照為陰性，其檢測MHV的敏感性為0.1 pg基因組DNA／μL，比RT－PCR靈敏10倍；將其用于55份臨床樣本的檢測，發現其陽性率為27.3%（15／55），而 RT－PCR為12.7%（7／55）。

1.3 諾如病毒 諾如病毒是一種杯狀病毒，是急性病毒性胃腸炎的常見病原體。Fukuda等［13］針對該病毒的RNA依賴的RNA聚合酶和衣殼蛋白編碼基因之間的保守區域設計3對引物進行RT－LAMP，發現諾如病毒反應管為陽性，而星形病毒、腺病毒和輪狀病毒對照為陰性，其檢測該病毒的敏感性為每管102～103copy；將其用于75例患者的糞樣檢測，發現其陽性率為100%（75／75），而 RT－PCR為94.7%（71／75）。

宋克云等［14］針對該病毒的RNA聚合酶基因設計2對引物進行RT－LAMP，發現48份諾如病毒GⅡ型反應管為陽性，而12份輪狀病毒A對照為陰性，其檢測該病毒的敏感性為15.6pg基因組DNA／管，與RT－PCR相當；將其用于48份患者的糞樣檢測，發現其陽性率為95.8%（46／48），與 RT－PCR檢測結果一致。

羅劍鳴等［15］針對該病毒的RNA依賴的RNA聚合酶和衣殼蛋白編碼基因區域設計3對引物進行RT－LAMP，發現諾如病毒GⅡ型反應管為陽性，而輪狀病毒、星狀病毒和諾如病毒GⅠ型對照為陰性，其檢測該病毒的敏感性為每管1000 copy，與RT－PCR相當；將其用于93份腹瀉患者的糞樣檢測，發現其陽性率為36.6%（34／93），而 RT－PCR為38.7%（36／93）。

Yoda等［16］針對該病毒的衣殼蛋白編碼基因的N末端區域設計3對引物進行RT－LAMP，發現諾如病毒GⅠ型和GⅡ型反應管均為陽性，而輪狀病毒A和輪狀病毒C對照均為陰性，其檢測該病毒的敏感性為每管80～200copy；將其用于88例腹瀉患者的糞樣檢測，發現其陽性率為81.8%（72／88），而RT－PCR為48.9%（43／88）。Fukuda等［17］用基于核苷酸序列擴增的RT－LAMP檢測14個牡蠣樣品，發現諾如病毒GⅠ型和GⅡ型的陽性率分別為為64.3%（9／14）和78.6%（11／14）。Iturriza等［18］用RT－LAMP試劑盒檢測510份腹瀉患者的糞樣，發現其陽性率為68.8%（350／510），而 RT－PCR為70.8%（361／510）。

2 呼吸道病毒LAMP檢測

2.1 流感病毒A 流感病毒A是甲型流感的病原體。Poon等［19］針對該病毒的 M基因設計2對引物進行RT－LAMP，發現22株流感病毒A反應管為陽性，而11株其他流感病毒對照為陰性，其檢測該病毒的敏感性為每管10－3PFU，而PCR為每管10－2PFU；將其用于47例鼻咽分泌物標本的檢測，發現其陽性率為46.8%（22／47）。

Ito等［20］針對該病毒的血凝素 A（hemagglutinin A，HA）編碼基因設計2對引物進行RT－LAMP，發現AH1株和AH3株反應管為陽性，其檢測該病毒的敏感性為10FFU／mL；將其用于83份鼻咽分泌物的檢測，發現其陽性率為85.9%（71／83），而病毒分離為94%（78／83）。

Kubo等［21］同樣針對該病毒的HA編碼基因設計3對引物進行RT－LAMP，發現333株H1N12009流行株反應管為陽性，而H3N2株對照為陰性，其檢測該病毒的敏感性為每管10copy；將其用于260個鼻咽拭子的檢測，發現其陽性率為52.3%（136／260），而RT－PCR為53.5%（139／260）。Ma等［22］用HA－RT－LAMP檢測發現26例H1N1株反應管為陽性，而24例其他流感病毒株對照為陰性，其檢測該病毒的敏感性為每管40copy。聶凱等［23］用 HA－RT－LAMP檢測證實美國甲型H1N1流感樣品反應管為陽性，而其他流感病毒株對照為陰性，其檢測該病毒的敏感性為每管60copy；將其用于30份人甲型H1N1流感患者的樣本檢測，發現其陽性率為90%（27／30），而 RT－PCR為83.3%（25／30）。張永樂等［24］用 HART－LAMP檢測發現36例甲型H1N1流感咽拭子樣品為陽性；其檢測該病毒的敏感性為每管103copy，比RT－PCR敏感10倍。

2.2 禽流感病毒A 禽流感病毒A是禽流感的病原體。李啟明等［25］針對該病毒的HA編碼基因或神經氨酸酶A（neuraminidase，NA）編碼基因分別設計3對引物進行RT－LAMP，發現禽流感病毒A H5N1株反應管為陽性，其檢測該病毒的敏感性為每管10copy；將其用于51份患者的樣品檢測，發現其陽性率為70.6%（36／51），與實時PCR相一致。

2.3 SARS冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS－Cov） SARS－Cov是 SARS的病原體。Thai等［26］針對該病毒的0RF1b基因設計3對引物進行 RTLAMP，發現SARS－Cov反應管為陽性，其檢測該病毒的敏感性為每管0.01PFU，而RT－PCR為每管1PFU；將其用于59個鼻咽拭子的檢測，發現其陽性率為22.0%（13／59），而RTPCR為10.0%（6／59）。Poon等［27］同樣針對該病毒的0RF1b基因設計3對引物進行RT－LAMP，發現SARS－Cov反應管為陽性，而呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感病毒A和B對照均為陰性，其檢測該病毒的敏感性為每管10copy；將其用于31例鼻咽拭子的檢測，發現其陽性率為64.5%（20／31）。

2.4 人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus，HRSV） HRSV是兒童呼吸道感染的主要病原體。Ushio等［28］針對該病毒的核殼蛋白編碼基因設計3對引物進行RTLAMP，發現HRSV反應管為陽性，而流感病毒A和B、麻疹病毒以及腮腺炎病毒對照為陰性，其檢測該病毒的敏感性為0.06TCID50；將其用于50份鼻咽拭子的檢測，發現其陽性率為94%（47／50），而病毒分離和 RT－PCR 為58%（29／50）和84%（42／50）。Shirato等［29］同樣針對該病毒的核殼蛋白基因設計3對引物進行RT－LAMP，發現HRSV反應管為陽性，而冠狀病毒、流感病毒和腺病毒對照為陰性，其檢測該病毒的敏感性為每管0.01～0.10PFU；將其用于59例鼻咽拭子的檢測，發現其陽性率為61%（36／59），而病毒分離和RT－PCR為34%（20／59）和68%（34／59）。

2.5 麻疹病毒 麻疹病毒是麻疹的病原體。Fujino等［30］針對該病毒的核蛋白的編碼基因設計3對引物進行LAMP，發現麻疹病毒反應管為陽性，其檢測該病毒的敏感性為0.04 TCID50，而RT－PCR為0.4TCID50；將其用于50例凍存4年的標本和11個新鮮標本的檢測，發現其陽性率分別為98%（49／50）和81.8%（9／11），而 RT－PCR分別為88%（44／50）和72.7%（8／11）。

2.6 腮腺炎病毒 腮腺炎病毒是流行性腮腺炎的病原體。Okafuji等［31］針對該病毒的血凝素－神經氨酸酶（hemagglutinin－neuraminidase，HN）編碼基因設計3對引物進行LAMP，發現腮腺炎病毒反應管為陽性，其檢測該病毒的敏感性為0.024PFU／μL，與RT－PCR相當；將其用于75個唾液拭子的檢測，發現其陽性率為64.0%（48／75），而 RT－PCR為62.7%（47／75）。

2.7 風疹病毒 風疹病毒是風疹的病原體。Mori等［32］針對該病毒的E1基因設計3對引物進行RT－LAMP，發現風疹病毒反應管為陽性，而麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒和流感病毒對照為陰性，其檢測該病毒的敏感性為30PFU／mL；將其用于9例患者的標本檢測，發現其陽性率為77.8%（7／9），而病毒分離和 RT－PCR為33.3%（3／9）和66.7%（6／9）。

2.8 新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV） NDV是雞瘟病的病原體。Pham等［33］針對該病毒的融合基因設計2對引物進行RT－LAMP，發現38株NDV反應管為陽性，而雞痘病毒和禽呼腸孤病毒對照為陰性，其檢測該病毒的敏感性為每管0.5pg，與巢式PCR相當；將其用于感染NDV 3d的雞肺氣管組織的檢測，發現其陽性率為75%（6／8），而感染6d標本的陽性率為100%。

2.9 結膜炎腺病毒 結膜炎腺病毒是眼科感染的常見病原體。Wakabayashi等［34］針對該病毒的Ad1亞型、ad3亞型和Ad4亞型的第6區基因以及ad8亞型、ad19亞型和ad37亞型的纖維區基因分別設計2對引物進行LAMP，發現這些亞型反應管均為陽性，其檢測該病毒的敏感性為每管103～104copy；將其用于13份臨床樣本的檢測，發現其陽性率為84.6%（11／13），而PCR為100%（13／13）。

3 展 望

將LAMP技術用于消化道和呼吸道病毒的檢測具有許多好處。因為LAMP技術針對保守靶序列的6個特定片段設計2～3對相關引物進行核酸擴增，所以核酸擴增具有較強的特異性；在LAMP剛開始反應時，以6n倍量進行核酸擴增，在1h內就能擴增出109～1010copy的靶序列基因，所以靈敏度較高，其靈敏度可與實時定量PCR相當，比傳統的PCR技術的靈敏度提高2～3個數量級；因為LAMP反應可生成肉眼可見的白色焦磷酸鎂沉淀，所以用目測即可鑒定結果；因為LAMP反應在等溫條件下進行，不需要變溫條件，所以不需要昂貴的PCR設備，操作步驟非常簡單，應用方便，所以在基層應用具有較廣闊的前景。

當然LAMP技術也有一些不可避免的缺點。因為LAMP引物設計需專門軟件，需設計引物2～3對，設計程序繁瑣，所以引物篩選工作將花費大量的時間和精力；因為LAMP引物之間可能存在互補結構而出現非特異條帶的擴增，所以出現假陽性的概率較多；LAMP反應擴增的靶序列基因長度通常不超過300bp，與非特異擴增的產物不宜鑒別；LAMP擴增的靶基因序列通常較短，所以不能進行基因的克隆、測序和表達；當進行常規LAMP反應完畢后，打開反應管時可造成氣溶膠污染；LAMP技術很難擴增長度大于500bp的靶基因，所以不能進行長鏈DNA擴增。隨著時間的推移，LAMP技術將不斷得到完善，在不遠的將來極有可能用于消化道和呼吸道病毒的臨床檢測。

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