冠心病患者血液循環miR－126表達的臨床意義研究

胡 旭，劉紅霞

（河南省南陽市中心醫院檢驗科 473001）

miRNA是一類小分子非編碼單鏈RNA，長度只有18～24個核苷酸，通過與靶基因mRNA 3′－UTR區互補配對，在翻譯水平調控基因的表達［1］。大量研究表明，miRNA與動脈粥樣硬化、高血壓、心肌肥厚等心血管疾病密切相關［2］。冠心病（coronary heart disease，CHD）是嚴重威脅人類健康的常見心血管疾病，其發病機制目前尚未明了，因此臨床上也缺乏有效的防治手段，探尋CHD的發病機制一直是學者們努力研究的方向［3］。血液循環中miRNA的變化與心血管疾病發病中的作用近年來逐漸受到關注，并已有研究使用循環miRNA作為心血管疾病診斷及藥物療效評價的生物標志物［4］，血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可以參與到動脈粥樣硬化病變中。本研究觀察CHD患者血液循環中miR－126和VEGF的表達變化，探討二者間相互調控關系及在CHD發生、進展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2010年12月至2013年2月本院診治的CHD患者66例，其中男38例，女28例，年齡43～69歲，平均（54.8±10.2）歲。CHD診斷參照2007中華醫學會心血管分會制定的診斷標準：冠狀動脈造影檢查確診（至少有一主要分支冠狀動脈狹窄大于或等于50%）。66例冠心病患者根據冠脈病變范圍分為單支病變20例、雙支病變24例、多支病變22例。另取本院同期健康體檢者20例作為對照組，其中男12例，女8例，年齡44～70歲，平均（54.6±10.4）歲。各組在性別、年齡等一般臨床資料比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 試劑和儀器 Trizol試劑購自TaKaRa公司；dNTPMix、Rnasin、M－MLV逆轉錄酶、TaqDNA聚合酶及緩沖系統購自美國Promega公司；逆轉錄莖環引物、Has－miR－126莖環引物由上海生工生物科技有限公司合成；VEGF檢測試劑盒購自深圳達科為生物技術有限公司。Real time－PCR儀為美國羅氏公司產品，全自動生化分析儀為日本日立（HICTHI－7080）公司產品。

1.3 miR－126表達的Real time－PCR檢測 采集受試者靜脈血2mL，3000r／min離心15min分離上清，取250μL用蛋白酶K于56℃水浴2h，加入Trizol按照試劑說明提取細胞總RNA，逆轉錄莖環引物和 M－MLV逆轉錄酶反轉錄，TaqDNA聚合酶、Has－miR－126莖環引物和SYBR Green熒光染料定量檢測miR－126的表達量。Has－miR－126莖環引物序列為5′－TAT CCA GTG ATT CCG ACC GCC GCA TGG AGT CTG－3′（正義鏈）和5′－TCC GCT CTT GGT GTG GTG TGA GTC GC－3′（反義鏈），內參照使用GAPDH基因。反應條件：94℃2min；94℃30s，6℃30s，72℃30s35個循環；72℃5min。△Ct值＝ miR－126Ct值－GAPDH Ct值，miR－126的表達量使用2－△Ct評估。

1.4 VEGF表達的測定 采集受試者靜脈血2mL，3000r／min離心15min分離上清待測。VEGF表達的測定使用ELISA法，嚴格按照試劑盒說明書操作，使用標準品繪制標準曲線，對照標準曲線計算VEGF的表達水平。

1.5 統計學處理 應用SPSS12.0統計軟件處理數據，實驗數據以表示，兩樣本均數比較先用方差分析，再采用t檢驗，Pearson相關性分析分析各檢測指標的相關關系，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組miR－126和VEGF表達的變化 對照組miR－126表達量0.316±0.072顯著高于CHD組0.227±0.053（P＜0.05），VEGF表達量（80.72±21.56）μg／mL顯著低于 CHD組（131.18±32.25）μg／mL（P＜0.05）。相關性分析顯示VEGF表達水平與miR－126表達呈顯著負相關（r＝－0.562，P＜0.05）。相關性分析顯示VEGF表達水平與miR－126表達呈顯著負相關（r＝－0.562，P＜0.05）。

2.2 不同冠脈病變患者miR－126和VEGF的表達 不同冠脈病變患者miR－126和VEGF表達存在顯著性差異（P＜0.05），miR－126表達隨著冠脈病變分支的增加而逐漸減低（P＜0.05），而VEGF表達隨著冠脈病變分支的增加而逐漸增加（P＜0.05）。見表1。

表1 CHD不同冠脈病變患者miR－126和VEGF表達的變化（）

表1 CHD不同冠脈病變患者miR－126和VEGF表達的變化（）

組別 n miR－126 VEGF（μg／mL）20 0.287±0.061 102.160±23.540雙支病變組 24 0.236±0.057 132.450±33.160多支病變組單支病變組22 0.182±0.040 155.740±40.220

3 討 論

近來的研究發現血液循環中存在大量的miRNA，并且血液循環中miRNA的表達譜會隨著疾病狀態的變化而變化，已有學者開始嘗試檢測血液循環中miRNA表達變化用于臨床疾病的診斷［5－6］。本研究顯示CHD患者外周血液循環中miR－126表達出現了顯著的減低，并且其有隨著冠脈病變分支的增加而逐漸減低的趨勢，提示了miR－126表達的下調可能參與了冠脈病的發生、發展過程。miRNA進入血液循環目前有兩種解釋：一種是組織細胞損傷后釋放入血，另一種是miRNA被一種50～100nm大小的微泡小顆粒包裹，這種小顆粒微泡可以逃脫血漿中高活性核糖核酸酶的酶解作用，起到細胞間傳遞、交流重要物質的作用［7］。

CHD是一種常見的老年性疾病，血管壁局部的脂質沉積導致的動脈粥樣硬化是基本的病理改變，VEGF是特異性促進血管內皮細胞有絲分裂的生長因子［8］。實驗研究已證實，VEGF在動脈粥樣硬化斑塊的增殖和活化中起著重要作用［9］。本研究觀察到CHD患者VEGF表達出現了顯著的升高，VEGF可以增加血管通透性，并促進巨噬細胞和單核細胞遷移到動脈粥樣硬化斑，借此在CHD的發生、發展中起著關鍵的作用［10］。VEGF表達會隨著冠脈病變分支的增加而逐漸增加，提示了VEGF表達的上調可能參與了CHD的發生、發展過程。

相關性分析顯示miR－126表達與VEGF表達水平呈顯著負相關，提示了二者之間存在相互調控的關系，說明CHD患者中VEGF表達的升高可能是因為miR－126在轉錄后對VEGF的調節失調所致，具體的調控分子機制還有待進一步的研究。Ishizaki等［11］研究也顯示miR－126聯合Egfl7基因可以參與到VEGF的調節信號通路中。

綜上所述，本研究顯示CHD患者中存在miR－126的異常表達，下調的miR－126失去了對VEGF的抑制可能是其參與CHD發生、發展的主要作用機制，miR－126的檢測可用于CHD病變的評估。

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［10］馬躍東，李德華.VEGF在心血管疾病治療中作用的研究進展［J］.中國老年學雜志，2011，31（9）：1703－1705.

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