D-氨基半乳糖聯合脂多糖誘導小鼠慢性肝損傷模型的建立

翟亞南，王晶晶，李 夢，池亞菲，孟 霞，彭博雅，焦 昆，盧 靜

(首都醫科大學,北京 100069)

肝臟疾病是人類最常見的疾病之一, 嚴重威脅著人類健康。為此,研發抗肝臟疾病的有效藥物顯得尤為重要。動物實驗是藥物進入臨床的必經之路,在研發抗肝臟疾病藥物過程中,選擇有科學性、實用性、重現性的肝損傷動物模型的意義十分重要[1]。目前，有很多藥物誘導肝損傷模型，但是重復性和模擬性好的藥物毒性大，或建模結果不夠穩定。D-氨基半乳糖毒性小，使用方便，但用于誘導大鼠肝損傷模型，有研究認為用于小鼠模型不穩定[2]。為此,本實驗就以D-氨基半乳糖聯合脂多糖(以下簡稱D+L)致小鼠慢性肝損傷模型的制備進行探討。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級健康雄性BALB/ c小鼠22只，體重18～22 g，購于北京維通利華實驗動物科學技術有限公司【SCXK(京)2012-0001】。在首都醫科大學實驗動物部屏障環境開展實驗【SYXK(京)2010-0020】。室溫20℃～25℃, 相對濕度40%～70%。小鼠分籠飼養, 每籠飼養3～4只，給予自由進食和飲水，飼料和飲水均經滅菌處理。

1.2 試劑與儀器

D-氨基半乳糖(Nanjing Boyuan Pharmatech Co.,Ltd，20100521)、脂多糖(美國Sigma公司，L2880，10 mg)、Masson染色試劑盒(南京建成科技有限公司，20100318)D+L注射液：1800 mgD-氨基半乳糖加入54 mL生理鹽水后，加入6 mL濃度為20 μg/mL脂多糖，配置成30 mg/mL lD-氨基半乳糖和2 μg/mL脂多糖的混合溶液、4%甲醛固定液：10 mL40%甲醛溶液加入90 mL蒸餾水10倍稀釋。石蠟包埋機(LeicaEG1160)、旋轉切片機(LEICA，RW2235)、烘片機(LEICAHI1220)、自動染色儀(LEICA，AUTOSTAINERXL)、電熱恒溫鼓風干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司，WG-7)、光學顯微鏡(Nikon)、Nikon數字顯微照相機(日本Nikon公司，Eccipse8oi)、圖像采集分析系統(NIS-ElementsBasicResearch)、水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司，HH-W600)、脫水機(Leica，ASP300S)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型制備和實驗組分組：22只BALB/ c小鼠隨機分成三組，空白對照組6只，LPS對照組8只，D+L組8 只，D+L組30 mg/mL gD-氨基半乳糖為+2 μg/mL脂多糖(LPS)混合液，空白對照組組同體重無菌生理鹽水，LPS對照組2 μg/mL脂多糖(LPS)溶液，1次/2天，連續注射8周，給予途徑均為腹腔。

1.3.2 取材: 10%水合氯醛麻醉后，用眼球動靜脈采血法取血1 mL，離心3000 r/min 10 min，取上清- 80℃凍存待測。用脫頸椎方法使小鼠安樂死，解剖取肝臟，觀察肝臟變化；取肝左葉于4%甲醛溶液固定,石蠟包埋,制備組織切片, 其余肝組織放置-80℃冰箱保存。

1.3.3 肝功能指標測定:采用日立7180全自動生化分析儀測定大鼠血清ALT、AST水平。

1.3.4 病理學及細胞凋亡變化:以石蠟包埋的肝組織標本制備4 μm切片, HE染色,鏡下觀察病理組織變化,包括肝細胞的變性壞死、炎性細胞浸潤、纖維間隔及假小葉的形成等病理變化。

1.3.5 肝組織切片水化脫蠟，使用Masson染色試劑盒染色，藍紫色表達為膠原纖維。

2 結果

2.1 一般情況

空白對照組小鼠毛發有光澤，活動正常，精神狀態良好，飲食量正常；LPS對照組小鼠毛發有光澤，活動較多，精神狀態良好，飲食量正常；實驗組小鼠毛發逐步凌亂無光澤,精神萎靡,活動漸少，飲食量少,對外界刺激反應遲鈍。

2.2 肝功能指標

如表1示，第8周D+L慢性肝損傷BALB/c小鼠血清ALT水平與空白對照組、LPS對照組比較，D+L組極顯著性增加(P< 0.01)；D+L組AST水平與空白對照組、LPS對照組比較，無明顯變化(P> 0.05)；AST/ALT比值，與空白對照組比較，D+L組顯著性降低(P< 0.05)，LPS組顯著性增加(P< 0.05)，與LPS對照組比較，D+L組極顯著性降低(P< 0.01)。

表1 第8周D+L肝損傷BALB/c小鼠血清ALT、AST水平組間比較

2.3 小鼠D+L慢性肝損傷過程中肝臟大體形態學、病理學變化

實驗第8周時，空白對照組肝臟呈鮮紅色,表面光滑、邊緣整齊,病理切片顯示肝細胞、匯管區、膽管上皮細胞等形態結構完整,未見變性、壞死等；LPS對照組與空白對照組比較，小葉結構，細胞形態排列等，未見明顯差異；D+L組肝臟體積縮小，邊緣變薄， HE染色可見(封底圖1)，肝小葉結構破壞，網狀纖維等支架組織發生明顯變化。10倍鏡下D+L組小鼠肝小葉結構紊亂，有結節性增生，40倍鏡下可見結節性增生區域，肝上皮細胞細胞核初相濃縮、溶解、壞死等現象，壞死灶密集分布，枯否氏細胞顯著增多。Masson染色(封底圖2)，空白對照組肝組織10倍鏡下可見均勻的淡藍色細條索狀染色，40倍鏡下可見藍染部位為肝上皮細胞間質；LPS組與正常對照組比較，染色性狀與部位未見明顯改變；D+L組肝組織出現大量結節樣藍色深染，特別是在肝上皮細胞大量變性壞死區域，藍色深染充斥整個區域，細碎偏淡的條狀藍染已經融合成粗大、深藍的結節樣改變。

3 討論

慢性肝損傷是一種多因素介導的復雜生物學過程，損傷的結果是肝細胞發生凋亡和壞死，損傷的誘因是多方面的[3]。ConA誘導(免疫性損傷)、對氨基酚藥物(藥物性損傷)和D-氨基半乳糖聯合脂多糖誘導(炎癥性損傷)等方法均可建立肝損傷動物模型[4]。本實驗采用D-氨基半乳糖聯合脂多糖誘導方法建立。D-氨基半乳糖誘發的動物肝損傷在形態學和功能上被認為與人的急性重癥肝炎類似。外源性脂多糖可增加氨基半乳糖的肝毒性, 同時氨基半乳糖也可導致脂多糖的感受性亢進。氨基半乳糖和脂多糖可導致廣泛性肝壞死,較常用于肝炎藥物的研發[1]。但是兩種藥物聯合誘導的慢性肝損傷動物模型，縱觀目前國內外文獻，較少，但是在臨床上，慢性肝損傷遠多于急性肝損傷病人。因此，慢性肝損傷動物模型的制備具有重要的研究意義。

脂多糖(LPS)是一種內毒素，可活化單核巨噬細胞,在體內主要通過脂多糖(LPS)結合蛋白、CD14等介導，與單核巨噬細胞、內皮細胞等靶細胞上的跨膜受體Toll樣受體4相結合，在淋巴細胞抗原96輔助下將信號轉入胞內，通過胞內復雜的信號途徑，導致TNF-α、IL-1、IL-6等炎性細胞因子及腫瘤壞死因子的產生，從而引起肝細胞損傷[5-6]。肝細胞內許多物質代謝過程與磷酸尿嘧啶核苷密切相關,足量的磷酸尿嘧啶核苷是維持肝細胞正常代謝及生物轉化功能的必要物質,如果發生耗竭,可以引起肝細胞損傷甚至壞死。D-氨基半乳糖(D-GalN)是一種肝細胞磷酸尿嘧啶核苷干擾劑,通過競爭生成二磷酸尿苷半乳糖使磷酸尿苷耗竭, 限制了細胞器的再生及酶的生成和補充，從而使細胞器受損，促使肝細胞的結構和功能均出現異常，導致物質代謝障礙,引起肝細胞變性、壞死[7]，并且D-氨基半乳糖(D-GalN)還可能與脂多糖(LPS)協同作用，通過導致內毒素血癥的途徑造成肝細胞損傷，促使聚集在受損肝細胞周圍的中性粒細胞產生暴發呼吸和脫顆粒，釋放氧自由基和導致脂質過氧化，作用于肝臟實質細胞和血管內皮細胞，導致細胞嚴重損傷或死亡[8]。因此，本實驗選用這兩種藥物聯合的方法誘導慢性肝損傷的發生。

肝損傷動物模型的建立是篩選保肝藥物的關鍵步驟之一。由于小鼠價格便宜,目前較多的文獻報道選用小鼠作為實驗動物[2]。有關慢性肝損傷模型的研究結果不盡相同，原因在于慢性損傷過程需較長的給藥時間，動物個體差異大，在長時間給藥過程中動物對藥物的反應差異越來越大，導致實驗系統的不穩定性。

根據預實驗，在保證極低死亡率情況下，本實驗采用30 mg/mL D-氨基半乳糖聯合2 μg/mL脂多糖混合溶液，采用連續腹腔注射法造模，每2天1次。研究報道，慢性肝損傷標準至少要求肝損傷狀態維持6 周以上，并伴有肝組織學的結構病變，如肝纖維化和肝硬化結節等[9]；常用的肝纖維化動物模型復制方法中，介紹給藥時間為9周[10]，綜上及預實驗結果，本實驗采取連續8周給藥的方法。

實驗結果顯示：在8周時，雖然D+L組與正常對照組比較，ALT、AST水平均有明顯的上升趨勢，但AST/ALT顯著性降低，依然提示此時雖然有明顯的細胞膜和細胞器損傷，但該損傷以細胞膜變性改變為主(表1、封底圖2)。

生理狀態下ALT與AST主要分布在肝臟的肝上皮細胞內，血清含量極少。在肝細胞中，ALT主要存在于非線粒體中。只要肝上皮細胞細胞膜稍有損壞，就可以使血清中ALT水平特異性升高。因此，ALT被世界衛生組織推薦為肝功能損害最敏感的檢測指標。而大約80%的AST存在于線粒體內, 只有當肝上皮細胞壞死時，血清中AST水平才會明顯升高[11]。

從組織形態學上，該模型也呈現出肝損傷的特征，壞死灶密集分布，枯否氏細胞顯著增多，小葉分界頗不清晰，結構紊亂,結節狀增多，40倍鏡下可見結節性增生區域肝上皮細胞細胞核濃縮、溶解、壞死，壞死細胞處出現枯否氏細胞聚集。而在相同部位Masson染色可見大量結節樣藍色深染，特別是在肝上皮細胞大量變性壞死區域，藍色深染充斥整個區域，細碎偏淡的條狀藍染已經融合成粗大、深藍的結節樣改變。

綜上本實驗建立的慢性肝損傷小鼠模型不僅具有較好的穩定性，而且具有明顯的生化、形態學、病理學特征。該模型的建立為研究慢性肝損傷的發病機制,探索慢性肝損傷治療新措施，篩選治療新藥物提供了新的選擇，具有重要意義。

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