BALB/cA-nu小鼠主要臟器參數、血生理生化指標和免疫細胞的測定

吳旭穎，田玉書，吳金峰，鄭偉斌，王 宇，王飛飛，張文明，楊志偉

(北京華阜康生物科技股份有限公司，北京 102200)

BALB/cA-nu小鼠是Charles River Japan(CRJ)公司通過對BALB/cABon-nu和BALB/cAnNCrj-nu進行交配和回交得到的品系，1985年CRJ得到了來源明晰的BALB/cAnNCrj-nu孕鼠，并在同年進行剖腹產，此小鼠為近交系，遺傳監測證實是BALB/c裸鼠，此小鼠胸腺缺失，為第11對染色體隱性遺傳。由于無胸腺，僅有胸腺殘跡或異常上皮，不能使T細胞正常分化，故造成T細胞缺陷。B淋巴細胞正常，但功能缺陷，抗體主要為IgM，只有少量IgG，無接觸敏感性，無移植排斥反應[1]。BALB/cA-nu小鼠作為免疫缺陷動物，目前已被廣泛應用到腫瘤學、免疫學和藥品與生物制品的安全性方面的評價以及有效藥品的篩選等實驗方面的研究[2]。BALB/cA-nu小鼠自從國外引進后已經超過20代，隨著飼養環境、營養、繁殖育種以及管理等諸多方面的差異，對于此小鼠的遺傳、生理生化以及免疫功能等生物學特性是否發生改變，尚缺乏了解，還需進一步驗證和探討，故我們對本單位5、10周齡的BALB/cA-nu小鼠的主要臟器重量、血液生理生化指標進行了測定；同時為驗證其免疫缺陷特性，我們采用流式細胞儀對6周齡的BALB/cA-nu小鼠的免疫細胞做了相關檢測，為我國利用該品系動物從事生物醫藥研究的科研人員提供基礎生物學數據。

1 材料和方法

1.1 動物來源

取SPF級BALB/cA-nu小鼠5、10周齡各24只，雌、雄比例1∶1，共計48只，用于臟器重量和血生理生化指標檢測；取6周齡的BALB/cA-nu小鼠4只，雌、雄比例1:1，用于免疫細胞測定。所有動物均由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，生產許可證號為：SCXK(京)2009-0004。該動物實驗于中國醫學科學院實驗動物研究所解剖實驗室進行，實驗動物使用許可證號為：SYXK(京)2013-0019。

1.2 飼養管理及環境

實驗BALB/cA-nu小鼠均飼養在北京華阜康生物科技股份有限公司SPF車間的隔離器內，隔離器內的潔凈度為5級標準，溫度控制在23±3℃，相對濕度40%～70%，換氣次數每小時為20次，明暗照明周期為12 h∶12 h，動物自由采食和飲水。

小鼠的飼料為北京華阜康生物科技股份有限公司生產的60Co小鼠繁殖料1315(SCXK(京)2009-0008)。飼料的營養成分為：粗蛋白≥23.0%、粗脂肪≥5.0%、粗灰分≤7.0%、粗纖維≤5.0%、水份≤10%、鈣1.4%～1.5%、磷1.0%～1.1%、賴氨酸≥1.32%、蛋氨酸+胱氨酸≥0.78%水為酸化過濾自來水(ph=2.7～3.0)并經121℃ 30 min高壓蒸汽滅菌,使用的墊料等物品均經過132℃ 30 min高壓蒸汽滅菌，每周更換1次墊料，進出隔離器的物品進行嚴格消毒，嚴格遵守隔離系統操作規程。

1.3 儀器及試劑

法國ABX Pentra DX 120血細胞分析儀和配套試劑、日立7100全自動生化分析儀和配套試劑、美國貝克曼Allegra 64R臺式高速冷凍離心機、美國BD公司流式細胞儀(FACS)、紅細胞裂解液(碧云天生物技術研究所)。

1.4 實驗方法

1.4.1 體重和臟器重量的測定：實驗前禁食12 h，禁水1 h，用電子天平稱取5、10周齡小鼠體重，眼眶采血后脫頸椎處死，立即剖取脾臟、肝臟、腎臟、心臟、肺臟、腦，并用濾紙吸干組織表面的水分，稱取重量。

1.4.2 血生理指標測定：從小鼠眼眶后靜脈叢采血，取0.2 mL血液到EDTA2k抗凝管內，進行血生理測定。12項血生理指標為：血紅蛋白(HGB)、紅細胞(RBC)計數、白細胞(WBC)計數、淋巴細胞(LYM)、血小板(PLT)、平均血小板體積(MPV)、血小板壓積(PCT)、紅細胞壓積(HCT)、平均紅細胞體積(MCV)、紅細胞平均血紅蛋白(MCH)、平均血紅蛋白濃度(MCHC)、紅細胞體積分布寬度(RDW)。

1.4.3 血生化指標測定：將剩余的全血取0.8 mL到離心管內，3000 r/min，離心10 min后取血清，進行血生化測定。15項血清生化指標為：總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLOB)、白蛋白/球蛋白(A/G)、谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、血糖(GLU)、總膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、總膽紅素(TBIL)、尿素氮(UN)、肌酐(CREA)、無機璘(P)、血鈣(Ca)。

1.4.4 免疫功能檢測方法：采用小鼠摘眼球取血法取300 μL外周血，經紅細胞裂解液去除紅細胞后，將細胞用1% BSA/PBS洗兩次后分為兩管備用。其中一管用PerCP-Cy5.5-CD3、APC-Cy7-CD4、FITC-CD8和PE-Cy7-NK1.1染色30 min，另一管用PerCP-Cy5.5-CD3、FITC-B220和APC-Cy7-CD11b染色30 min，洗后用流式細胞儀檢測并用FCS Express V3.0軟件分析數據。免疫細胞測定：T細胞(CD3+、CD4+、CD8+)、B細胞(CD19+、B220+)、NK細胞(NK1.1+)、粒細胞(CD11b+)。

1.5 結果處理

實驗數據采用SPSS19.0軟件進行單因素方差統計分析，以平均數±標準差(x±S)表示，顯著水平為P< 0.05。

2 結果

2.1 BALB/cA-nu小鼠臟器測定結果

由表1可見，同周齡的BALB/cA-nu小鼠，雄鼠的體重、肝臟和雙腎重量高于雌鼠(P< 0.05)。同性別的BALB/cA-nu小鼠，5周小鼠的肺臟、肝臟、雙腎重量明顯低于10周齡小鼠(P< 0.05)。

表1 BALB/cA-nu小鼠主要臟器重量(單位：g)

2.2 BALB/cA-nu小鼠血生理指標測定結果

由表2可見，同周齡的BALB/cA-nu小鼠,雄鼠HGB、MCH和HCT的值高于雌鼠(P< 0.05)。同性別的BALB/cA-nu小鼠，5周小鼠RDW的值高于10周齡小鼠(P< 0.05)。

2.3 BALB/cA-nu小鼠血生化指標測定結果

由表3可見，同周齡的BALB/cA-nu小鼠，雄鼠TBIL的值高于雌鼠(P< 0.05)。同性別的BALB/cA-nu小鼠，5周小鼠TP、GLOB、CHO、TBIL、UN的值明顯低于10周齡小鼠(P< 0.05)，而5周小鼠A/G的值高于10周齡小鼠(P< 0.05)。

2.4 BALB/cA-nu小鼠免疫細胞測定結果

圖1顯示的是一只BALB/cA-nu小鼠外周血中T細胞及其亞群、B細胞、NK細胞和粒細胞的百分比。

由圖2可見，BALB/cA-nu 小鼠外周血無T細胞(0.18±0.06)%、CD4+T細胞(0.26±0.08)%、CD8+T細胞(0.13±0.04)%,CD19+B細胞的比例為(30.10±2.74)%、B220+ B細胞的比例為(30.55±2.77)%，NK細胞比例為(1.35±0.29)%，粒細胞比例為(47.90±5.48)%。

表2 BALB/cA-nu小鼠血生理指標

表3 BALB/cA-nu小鼠血生化指標

圖1 BALB/cA-nu小鼠外周血免疫細胞百分比

圖2 BALB/cA-nu小鼠免疫細胞百分比

3 結論

截止目前，國內報道有關BALB/cA-nu小鼠的主要臟器重量，血生理生化指標以及免疫細胞等基本生物學特性的文獻并不多，而這些指標又都是動物實驗中的重要基礎數據。臟器重量是鑒定動物遺傳品質的重要依據，而血生理生化值又是生物醫藥研究的基礎指標，本研究通過對5、10周齡BALB/cA-nu小鼠的主要臟器重量、12項血生理、15項血生化指標進行統計分析，結果表明，同周齡的BALB/cA-nu小鼠的雌雄相比，體重、肝臟、雙腎重量差異具有顯著性，此結果與文獻[3]報道結果一致，血生理指標HGB、MCH差異有顯著性與張修彥的BALB/c小鼠的報道相一致[4]；同性別小鼠的5周與10周相比，肺臟、肝臟、雙腎差異具有顯著性，TP、GLOB、A/G、CHO、TBIL、UN血生化指標差異顯著。

另外，本研究中測定BALB/cA-nu小鼠的主要臟器，血生理生化的數據，通過與日本SLC公司的1998年的數據集中刊登的10周齡的BALB/c Slc-nu/nu小鼠相比，脾臟、WBC、GLU、CREA、TBIL的值稍低，其余各項值很接近[5]；與Charles River公司2011年1月至2012年12月刊登的8～10周齡的BALB/c Nude小鼠相比，血生理很接近，只有血生化中GLU、CREA、TBIL的值偏低[6]。造成此類差異的因素，除品系、飼養環境、營養因素外，樣品的采集、貯存處理、儀器、試劑及人員操作等因素的影響也是至關重要的，尤其是GLU、TBIL分別對時間和光照的敏感性，據趙曉紅報道[7]血液離體后，隨著時間的延長，全血中的葡萄糖被分解代謝，血糖濃度逐漸下降，大約每小時下降5%～7%；血液中的總膽紅素，絕大部分為非結合膽紅素，血樣在受到光照后，使膽紅素中相當部分的非結合膽紅素形成構型異構體，繼而進一步形成結構異構體，由于結構異構體不能參與重氮反應，導致測得TBIL比實際的值低[8]，但TBIL值偏低，在臨床上無相對意義。另外，實驗前動物禁食時間的差異，也對WBC、CREA、GLU等指標有影響[9]。

BALB/cA-nu小鼠作為免疫缺陷動物，因其T細胞特異性免疫缺陷，使其被廣泛地應用到免疫學和藥物研發研究[10]。機體的特異性免疫功能分為細胞免疫和體液免疫，細胞免疫過程主要是由T淋巴細胞介導的，通過T淋巴細胞特異性地識別抗原，使T細胞活化、增殖和分化，發揮免疫效應。T細胞抗原受體(TCR)和CD3+均為T細胞膜上的重要分化抗原，是成熟T細胞的特征性標志，T細胞表面的TCRCD3+構成復合體；CD4+和CD8+是T細胞表面的糖蛋白，CD4+主要表達MHCⅡ限制的T細胞，CD8+主要表達MHCⅠ限制的T細胞,CD4+和CD8+作為輔助分子增強T細胞和抗原提呈細胞(APC)或CTL靶細胞間的相互作用。CD4+和CD8+的功能與TCR的功能錯綜復雜地聯系在一起，因此CD4+和CD8+分子通常被視為判斷和鑒定T細

胞亞群及其成熟的標志。B淋巴細胞是唯一能夠產生抗體的細胞，B220+是小鼠全B細胞最常用標記，但這個標記也表達于活化T細胞、活化NK細胞和NK祖細胞。相對來說，CD19+是B細胞較特異的標記,主要表達大多數B細胞，從祖B細胞階段開始表達直至漿細胞階段[11-13]。因此我們通過標記6周齡BALB/cA-nu小鼠全血中的CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、B220+、NK1.1+、CD11b+抗體基檢測此小鼠體內不同的免疫細胞情況，結果表明BALB/cA-nu小鼠表現為T細胞免疫缺陷。

參考文獻：

[1] Shanru Li,Dong ping Wang,Xiuling Yu,et al.a new mutation causing hairless on mouse chromosome 11[J].Genet Res Camb,1999,73:233-238.

[2] 吳細丕，錢林法.實驗動物與腫瘤研究[M].北京：中國醫藥科技出版社，2000:18.

[3] 練有文，王暉，倪少凱，等. BALB/c系裸小鼠臟器重量、臟器系數的測定[J].中國比較醫學雜志，2006,16:285-287.

[4] 張修彥，詹純列，肖育華，等.SPF級BALB/c小鼠臟器質量、臟器系數、血常規、血生化指標的測定與比較[J].中國組織工程研究與臨床康復，2011,15:7734-7737.

[5] 日本SLC公司1998-實驗動物數據集[M]，1998,46.

[6] http://www.criver.com/files/pdfs/rms/balbc-nude/rm_rm_r_balb-c_nude_mouse_clinical_pathology_data.aspx.

[7] 趙曉紅，血液標本存放時間對生化檢驗結果的影響研究[J].中國保健營，2013,4:2127.

[8] 劉玉霞,朱晴暉.結合膽紅素和非結合膽紅素的直接測定在高膽紅素血癥中的應用[J].檢驗醫學,2008(2):156- 159.

[9] 柯斌，秦鑒，張俊杰.短期禁食對大鼠生理生化指標的影響[J].時珍國醫國藥，2011,22:2778-2780.

[10] 練有文，王暉，倪少凱，等.不同飼養密度對SPF級BALB/cA裸鼠血生化指標的影響[J].廣東醫學院學報，2010,28:120-122.

[11] 龔非力，主編.醫學免疫學，科學出版社.2000,6：P92-107.

[12] 林學顏，張玲，主編.現代細胞與分子免疫學，科學出版社.1999,8:12-190.

[13] 王冬平，欒蓉暉，李善如，等.BALB/c突變無毛小鼠特異性免疫功能的研究[J].中國實驗動物學報，2003,11(1):23-25.