Rag2敲除小鼠臟器重量、血液生理生化指標及免疫細胞的研究

王 宇，吳旭穎，魏詔盛，吳金峰，劉會真，田玉書，張文明，楊志偉

(北京華阜康生物科技股份有限公司，北京 102200)

Rag2是由白細胞介素4與costimuli(脂多糖等細胞因子)結合后表達于成熟小鼠B細胞，Rag2基因長度大約18 kb，在V(D)J基因重排和淋巴系細胞發育中的關鍵性作用[1-4]。Rag2 KO小鼠的表現型是嚴重的T/B細胞早期發育阻滯，T細胞停滯于CD3-CD4-CD8-CD25+階段，而B細胞停滯于B220- CD43+IgM- B細胞階段。它們的外周血沒有成熟的循環T/B淋巴細胞，這與人重癥聯合免疫缺陷綜合征SCID非常相似，并且都有V(D)J基因重排缺陷。

純合的Rag2 KO小鼠是整個Rag2蛋白編碼區缺失。但是，該小鼠可以生長繁殖。Rag2突變小鼠具有第三外顯子目標基因的缺失。美國The Jackson Laboratory公司描述了純合的Rag2 KO小鼠、Rag2第三外顯子突變小鼠以及Rag2第三外顯子未發生突變的小鼠具有同樣的表型。鑒于該小鼠的這種表型，可用于免疫學、血液學、腫瘤、炎癥反應等多領域的生命科學研究。

該小鼠自國外引進以來，飼養條件與國外發生了一定的變化，但是，我國還沒有關于該小鼠系統的基礎生理生化參數的研究和報道，本研究擬對Rag2 KO小鼠的臟器重量、血液生理生化指標及免疫細胞進行測定，為我國科研人員利用該小鼠進行生命科學研究和生物醫藥研發提供基礎參考資料。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

取SPF級Rag2 KO小鼠5、10周齡各24只，雌、雄比例1:1，共計48只，用于臟器和血生理生化檢測；取6周齡的Rag2 KO小鼠4只，雌、雄比例1:1，用于免疫細胞檢測。所有動物均由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，生產許可證號為：SCXK(京)2009-0004。

1.2 飼養環境

Rag2 KO小鼠均飼養在符合國家相關標準的隔離環境內，隔離環境的潔凈度標準為5級，溫度控制為22℃～26℃，相對濕度為40%～70%，每小時換氣20次，明暗周期為12 h：12 h，動物自由采食和飲水。

所用飲水、墊料均經高壓滅菌，飼料為自行配制加工的全價顆粒繁殖飼料并經60Co照射滅菌，該產品為北京華阜康生物科技股份有限公司生產，產品編號為小鼠繁殖飼料1035，生產許可證號為：SCXK(京)2009-0008。營養成分為：粗蛋白≥23.0%、粗脂肪≥5.0%、粗灰分≤7.0%、粗纖維≤5.0%、水份≤10%、鈣1.4%～1.5%、磷1.0%～1.1%、賴氨酸≥1.32%、蛋氨酸+胱氨酸≥0.78%。水為酸化過濾自來水(ph=2.7～3.0)并經121℃ 30 min高壓蒸汽滅菌，使用的墊料等物品均經過132℃ 30 min高壓蒸汽滅菌，每周更換1次墊料，飼料和水自由攝取。每周更換1次墊料，進出隔離環境的物品進行嚴格消毒，并嚴格遵守隔離系統動物實驗室標準操作及管理規程。

1.3 實驗環境

動物實驗于中國醫學科學院實驗動物研究所解剖實驗室，實驗動物使用許可證號為：SYXK(京)2013-0019。

1.4 儀器及試劑

法國ABX Pentra DX 120血細胞分析儀和配套試劑、日立7100全自動生化分析儀和配套試劑、美國貝克曼Allegra 64R臺式高速冷凍離心機、美國BD公司流式細胞儀(FACS)、紅細胞裂解液(碧云天生物技術研究所)。

1.5 實驗方法

1.5.1 體重和臟器重量的測定：實驗前禁食12 h，禁水1 h，用電子天平稱取5、10周齡小鼠體重，眼眶采血后脫頸椎處死，立即剖取脾臟、肝臟、腎臟、心臟、肺臟、腦，并用濾紙吸干組織表面的水分，稱取重量。

1.5.2 血生化指標測定：將剩余的全血取0.8 mL到離心管內，3000 r/min，離心10 min后取血清，進行血生化測定。15項血清生化指標為：總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLOB)、白蛋白/球蛋白(A/G)、谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、血糖(GLU)、總膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、總膽紅素(TBIL)、尿素(UN)、肌酐(CREA)、無機璘(P)、血鈣(Ca)。

1.5.3 血生理指標測定：從小鼠眼眶后靜脈叢采血，取0.2 mL血液到EDTA2k抗凝管內，進行血生理測定。12項血生理指標為：血紅蛋白(HGB)、紅細胞(RBC)計數、白細胞(WBC)計數、淋巴細胞%(LYM%)、血小板(PLT)、平均血小板體積(MPV)、血小板壓積(PCT)、紅細胞壓積(HCT)、平均紅細胞體積(MCV)、紅細胞平均血紅蛋白(MCH)、平均血紅蛋白濃度(MCHC)、紅細胞體積分布寬度(RDW)。

1.5.4 免疫細胞檢測方法：采用小鼠摘眼球取血法取300 uL外周血，經紅細胞裂解液去除紅細胞后，將細胞用1% BSA/PBS洗兩次后分為兩管備用。其中一管用PerCP-Cy5.5-CD3、APC-Cy7-CD4、FITC-CD8和PE-Cy7-NK1.1染色30 min，另一管用PerCP-Cy5.5-CD3、FITC-B220和APC-Cy7-CD11b染色30 min，洗后用流式細胞儀(FACS，Aria)檢測并用FCS Express V3.0軟件分析數據。免疫細胞測定：T細胞(CD3+、CD4+、CD8+)、B細胞(CD19+、B220+)、NK細胞(NK1.1+)、粒細胞(CD11b+)。

1.6 統計學處理

采用SPSS19.0軟件進行單因素方差統計分析，以平均值±標準差(x±S)表示，顯著水平為P< 0.05。

2 結果

2.1 Rag2 KO小鼠臟器檢測結果

表1可見，同周齡的Rag2 KO小鼠相比，雄性小鼠心臟、雙腎臟、肝臟、脾臟重量高于雌鼠(P< 0.05)；同性別的Rag2 KO小鼠相比，10周小鼠腦、肺臟、脾臟、肝臟、心臟、雙腎臟重量高于5周小鼠(P< 0.05)。

2.2 Rag2 KO小鼠血液生化檢測結果

由表2可見，同周齡的Rag2 KO小鼠相比，雄性小鼠AST、ALP、A/G、GLU高于雌性小鼠，CHO、TG、TP、GLOB低于雌性小鼠(P< 0.05)；同性別的Rag2 KO小鼠相比，5周小鼠TG、UN、CREA、ALP高于10周小鼠，TBIL低于10周小鼠(P< 0.05)。

2.3 Rag2 KO小鼠血液生理檢測結果

由表3可見，同周齡的Rag2 KO小鼠相比，雄性小鼠PLT、PCT、WBC、LYM%高于雌性小鼠(P< 0.05)；同性別的Rag2 KO小鼠相比，10周小鼠RDW低于5周小鼠，WBC高于5周小鼠(P< 0.05)。

2.4 Rag2 KO小鼠免疫細胞測定結果

圖1顯示的是一只Rag2 KO小鼠外周血中T細胞及其亞群、B細胞、NK細胞和粒細胞的百分比。由圖2 可見，Rag2 KO小鼠外周血無T細胞(0.36±0.15)%、CD4+T細胞(0.21±0.06)%、CD8+T細胞(0.23±0.07)%、CD19+ B細胞(0.28±0.04)%和B220+ B細胞(2.03±0.42)%)。NK細胞比例為(24.13±3.62)%，粒細胞比例為(57.20±3.85)%。

表1 Rag2 KO小鼠主要臟器重量(單位：g)

表2 Rag2 KO小鼠主要血生化指標檢測結果

表3 Rag2 KO小鼠主要血生理指標檢測結果

圖1 Rag2 KO小鼠外周血免疫細胞百分比

圖2 Rag2 KO小鼠免疫細胞百分比

3 結論

實驗動物臟器重量是鑒定動物遺傳品質的重要依據，同時也是動物實驗中常用的重要基礎數據。本實驗避開小鼠6～8周齡性成熟激素調節較為不穩定階段，為防止對生理生化及臟器產生影響，實驗選取5周齡青年小鼠及10周齡壯年小鼠進行對比研究[5]。本研究結果表明同性別不同周齡小鼠，隨著周齡增加各臟器重量遞增。同一周齡的雌性小鼠和雄性小鼠相比較，肝臟、脾臟、心臟及雙腎臟器重量雄性小鼠大于雌性小鼠。本研究結果與Jackson Laboratory 及SLC所公布的C57BL/6J小鼠各臟器參數比較，除了脾臟偏低，其他臟器無顯著性差異[6-7]。脾臟偏低可能由于該小鼠為基因敲除小鼠引起，同時飼料、環境等因素也可引起該臟器重量偏低[8]。

本實驗對Rag2 KO進行了15種血液生化指標的測定和初步統計。結果顯示，同周齡的Rag2 KO小鼠雄鼠和雌鼠相比，CHO、TP、GLOB三個指標雄性小鼠高于雌性小鼠；AST、ALP、A/G、GLU四個指標雌性小鼠高于雄性小鼠。5周與10周同性別的Rag2 KO小鼠相比，TBIL 隨著周齡增加而遞增，TG、UN、CREA、ALP隨著周齡增加而遞減。這是否是在一定時間內(如3個月以上) 可能呈現規律性變化，還有待進一步研究。可見年齡及性別因素對部分血液生化指標的影響是十分明顯的，但是也與品種品系不同、飼養環境不同等多種因素有關，切不可一概而論[9-10]。本研究結果與Jackson Laboratory、Charles river 及SLC所公布的C57BL/6J小鼠血液生化指標比較，Jackson Laboratory、Charles river兩個公司公布的數據偏低，比SLC所公布的數據普遍偏高，可能由于動物品系不同有一定差異，Rag-2 KO小鼠為免疫缺陷小鼠，在外界更易產生應激使機體產生一系列生理生化變化，且缺少免疫細胞，易對外界刺激產生炎癥反應。而C57為正常健康小鼠，不會對外界產生過于敏感的反應，生理生化值也相對穩定。同時由于飼料及環境等因素的影響也會導致生化指標的偏差[6-7,11]。

本實驗對Rag2 KO進行了12種血液生理指標的測定和初步統計。結果顯示，同周齡的Rag2 KO小鼠雄鼠和雌鼠相比，PLT、PCT、WBC、LYM% 雄性小鼠高于雌性小鼠；5周與10周同性別的Rag2 KO小鼠相比，RDW10隨著周齡增加而遞減，WBC隨著周齡增加而遞增。根據醫學資料顯示，RDW隨周齡增大而減少，可能由于貧血造成；同時，WBC隨周齡增加而增加，顯示白細胞炎癥增加。由于Rag2-KO為免疫缺陷小鼠，該兩個指標的變化，初步推斷由于該品系小鼠的生物學特性導致。本研究結果與Jackson Laboratory、Charles river 及SLC所公布的C57BL/6J小鼠部分血液生理指標比較，無顯著差異[6-7,11]。

Rag2 KO小鼠表現型為嚴重的T/B細胞早期發育組滯。它的外周血沒有成熟的循環T/B淋巴細胞，但是存在NK細胞(NK1.1+)和粒細胞(CD11b+)，這與人重癥聯合免疫缺陷綜合征SCID非常相似[12]。由于該基因小鼠特殊繁殖方式，為避免母體的抗體對Rag2 KO小鼠免疫檢測造成干擾，特選離乳后2～3周動物，即6周齡小鼠進行檢測。因此我們通過標記6周齡Rag2 KO小鼠全血中的CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、B220+、NK1.1+、CD11b+抗體檢測Rag2 KO小鼠體內不同的免疫細胞情況，證實Rag2 KO小鼠表現為明顯的T、B細胞聯合免疫缺陷。Rag2 KO小鼠作為免疫缺陷動物，在異種移植及移植宿主的腫瘤研究和毒理學研究上得到了廣泛的應用。

由于國內Rag2 KO小鼠研究剛起步，因此未見此動物臟器重量、血生理生化指標的報道。本研究為生物醫學研究提供了基礎數據。Rag2 KO小鼠作為實驗動物在國內尚屬先例，所以對它的一些基本生物學特性尚缺乏系統的研究。由于此動物現已形成一定規模，群體相對穩定，其生物學特性和健康狀況也相對穩定，因此，記錄和結果數據較為集中，本實驗對該動物的主要血液生化指標的檢測具有一定的參考意義，為其在生物醫學領域中的應用提供了基礎數據。

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