KK/Upj-Ay/J小鼠主要臟器重量和血液生理生化指標的觀察

劉 旭，吳旭穎，王 宇，唐光毅，田玉書，吳金峰，張文明，楊志偉

(北京華阜康生物科技股份有限公司，北京 102200)

KK小鼠是由近藤恭司教授于1957年采用日本本土小鼠通過近交獲得的。西村正彥[1-2]教授在1967年將基因Ay導入KK小鼠體內獲得KKAy小鼠，因為體毛呈黃色，也稱為yellow KK。Ay突變基因為毛色基因，表現為黃色，不僅可以影響小鼠的毛色還可以引起代謝紊亂，與肥胖和糖尿病的發生有關。KKAy小鼠與正常小鼠相比表現為過量飲食、中度肥胖、高血糖、胰島素抵抗等代謝異常綜合征，接近于人類Ⅱ型糖尿病早期病變的特征，是一種廣泛應用于Ⅱ型糖尿病和肥胖研究的自發型動物模型[3]。KK/Upj-Ay/J小鼠是KK自發糖尿病小鼠的突變同源近交系，于1998年從Jackson Laboratory引進到國內。經過多代的繁育，飼養環境、營養水平已經發生了改變，有必要對該品系小鼠的相關生物學特征進行驗證和探討。因此我們對本公司5、10周齡KK/Upj-Ay/J小鼠的主要臟器重量、血液生理生化等指標進行了測定，為利用該品系進行Ⅱ型糖尿病及肥胖癥研究提供一些基礎的生物學資料。

1 材料和方法

1.1 動物來源

取SPF級KK/Upj-Ay/J小鼠5、10周齡各24只，雌雄各半，共計48只，均由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，生產許可證號為：SCXK(京)2009-0004。該動物實驗于中國醫學科學院實驗動物研究所解剖實驗室進行，實驗動物使用許可證號為：SYXK(京)2013-0019。

1.2 飼養管理及環境

實驗KK/Upj-Ay/J小鼠均飼養在北京華阜康生物科技股份有限公司SPF車間的隔離環境(隔離器)內，隔離環境的潔凈度為5級標準，溫度控制在24±2℃，相對濕度50%±10%，換氣次數每小時為20次，明暗照明周期為12 h:12 h，動物自由采食與飲水。

實驗用料為北京華阜康生物科技股份有限公司生產的60Co輻射滅菌的鼠繁殖料1035(SCXK(京)2009-0008)。主要營養指標為：粗蛋白23.82%、粗脂肪5.16%、粗灰分7.19%、粗纖維4.62%、水分8.81%、鈣1.25%、磷0.97%、賴氨酸1.55%、蛋氨酸+胱氨酸0.91%。飲用水為酸化過濾自來水(ph=2.7～3.0)并經121℃ 30 min高壓蒸汽滅菌。使用的籠具、水瓶、墊料等物品均經過132℃ 30 min高壓蒸汽滅菌，每周更換一次墊料，進出隔離器的物品均進行消毒處理，嚴格遵守隔離系統操作規程。

1.3 儀器及試劑

法國ABX Pentra DX 120血細胞分析儀和配套試劑、日立7100全自動生化分析儀和配套試劑、美國貝克曼Allegra 64R臺式高速冷凍離心機。

1.4 實驗方法

1.4.1 體重和臟器重量的測定

實驗前禁食12 h，禁水1 h，用電子天平稱取5、10周齡小鼠體重，眼眶采血后脫頸椎處死，立即剖取脾臟、肝臟、腎臟、心臟、肺臟、腦、胸腺，并用濾紙吸干組織表面的水分，稱取重量。

1.4.2 血生理指標測定

從小鼠眼眶后靜脈叢采血，取0.2 mL血液到EDTA2k抗凝管內，進行血生理測定。12項血生理指標為：血紅蛋白(HGB)、紅細胞(RBC)計數、白細胞(WBC)計數、淋巴細胞(LYM)、血小板(PLT)、平均血小板體積(MPV)、血小板壓積(PCT)、紅細胞壓積(HCT)、平均紅細胞體積(MCV)、紅細胞平均血紅蛋白(MCH)、平均血紅蛋白濃度(MCHC)、紅細胞體積分布寬度(RDW)。

1.4.3 血生化指標測定

將剩余的全血取0.8 mL到離心管內，3000 r/min，離心10 min后取血清，進行血生化測定。15項血清生化指標為：總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLOB)、白蛋白/球蛋白(A/G)、谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、血糖(GLU)、總膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、總膽紅素(TBIL)、尿素氮(UN)、肌酐(CREA)、無機璘(P)、血鈣(Ca)。

1.5 結果處理

實驗數據以平均值±標準差表示，采用SPSS19.0進行單因素方差分析，顯著水平為P< 0.05。

2 結果

2.1 KK/Upj-Ay/J小鼠臟器重量的測定結果

由表1可見，5周齡KK/Upj-Ay/J小鼠雌雄相比臟器重量沒有顯著性差異；10周齡KK/Upj-Ay/J雄鼠的雙腎、肝臟、心臟和胸腺重量高于雌鼠(P< 0.05)。10周齡雌鼠的體重、脾臟、雙腎、肝臟、心臟、肺臟和腦重量高于5周齡雌鼠(P< 0.05)； 10周齡雄鼠的體重、脾臟、雙腎、肝臟、心臟和肺臟重量高于5周齡雄鼠(P<0.05)。

2 KK/Upj-Ay/J小鼠血生理的測定結果

由表2可見，5周齡KK/Upj-Ay/J雄鼠的RLT高于雌鼠(P< 0.05)；10周齡KK/Upj-Ay/J雌鼠的WBC、HGB、MCV、MCH和LYM高于雄鼠(P< 0.05)。10周齡雌鼠的WBC、RBC、HGB、HCT和LYM高于5周齡雌鼠(P< 0.05)；10周齡雄鼠的RBC、MCV、MCH、RLT和LYM高于5周齡雄鼠(P< 0.05)。

表1 KK/Upj-Ay/J小鼠主要臟器重量(單位：g)

表2 KK/Upj-Ay/J小鼠血生理指標

表3 KK/Upj-Ay/J小鼠血生化指標

2.3 KK/Upj-Ay/J小鼠血生化的測定結果

由表3可見，5周齡KK/Upj-Ay/J雄鼠的CHO、Ca和P高于雌鼠，A/G值則低于雌鼠(P< 0.05)；10周齡KK/Upj-Ay/J雄鼠的GLOB、ALT和P高于雌鼠，ALB、A/G、CHO和CREA則低于雌鼠(P< 0.05)。10周齡雌鼠的ALB、A/G、CHO、TPIL和Ca高于5周齡雌鼠，GLOB、ALT、ALP、TG和P則低于5周齡雌鼠(P< 0.05)；10周齡雄鼠的GLU和TBIL高于5周齡雄鼠，CHO、TG和P則低于5周齡雄鼠(P< 0.05)。

3 討論

KK/Upj-Ay/J小鼠是KK自發糖尿病小鼠的突變同源近交系，基因型為Ay/a雜合子，毛色表現為黃色，眼為黑色；小鼠在8周齡左右出現高血糖，高胰島素和葡萄糖耐受不良等癥狀，出生后幾個月由于變得肥胖而不育。是一種廣泛應用于肥胖和2型糖尿病研究的試驗動物模型。截止目前國內外使用KKAy小鼠進行Ⅱ型糖尿病和降血糖的研究很多，但對于KK/Upj-Ay/J小鼠的主要臟器，血生理生化等基本生物學特征的研究不多，而這些指標又是利用該品系小鼠進行科學研究的重要參考數據。

本研究選取5周齡青年小鼠和10周齡壯年小鼠進行對比研究，避開6～8周逐漸性成熟的不穩定時期[4]。通過對5、10周齡的KK/Upj-Ay/J小鼠的主要臟器重量、12項血生理和15項血生化指標進行統計分析，結果表明：不同周齡和性別的KK/Upj-Ay/J小鼠在臟器重量和血生理生化上有差異性。可見周齡和性別對臟器和血生理生化是有一定影響的。

KK糖尿病小鼠是自發突變糖尿病模型，呈多基因遺傳性，KKAy源于KK鼠，因此KKAy小鼠的糖尿病遺傳背景也為多基因遺傳性疾病。研究表明，在普通飼養條件下只有約40%～50%的KKAy小鼠在8周齡左右出現高血糖、肥胖等糖尿病癥狀，但在飼喂高能量飲食的條件下有75%左右的KKAy小鼠發展為糖尿病[5]。例如飼喂KK/Upj-Ay/J小鼠KK鼠專用飼料，可以使KK鼠保持典型的模型特征(高血糖、高胰島素血癥、胰島素拮抗、過量飲食和肥胖等)[6]。這說明遺傳因素控制著KK/Upj-Ay/J小鼠Ⅱ型糖尿病的發病，決定了該品系對Ⅱ型糖尿病的易感性，但飲食作為一個重要的環境因素在發病過程中也起著重要的作用[7-8]。通過把本研究的體重和血糖與其他研究比較分析發現，在10周齡時我們的KKAy小鼠體重略低[1,9-10]，這可能是由于飼喂飲食的能量值不同及未做禁食處理有關。相近周齡的空腹血糖值較相關報道略高[11]，根據空腹血糖≥7.0 mmol/L即判定為糖尿病發病的一般判定標準[7]，KK/Upj-Ay/J小鼠在10周齡時基本上出現糖尿病的癥狀。因此，本研究表明KK/Upj-Ay/J小鼠在10周齡左右出現高血糖癥狀，可以做為Ⅱ型糖尿病及肥胖癥的研究模型，配合高能量飲食飼喂可獲得更好的研究效果。

參考文獻：

[1] HISASHI IWATSUKA, AKIO SHINO, ZIRO SUZUOKI. General Survey of Diabetic Features of Yellow KK Mice[J].Endocrinol,1970,17(1):23-25.

[2] http://jaxmice.jax.org/strain/002468.html

[3] 張連峰,秦川.小鼠資源和比較醫學信息[M].北京,2009.

[4] 李厚達.實驗動物學(2)[M]，中國農業出版社，2003:100-103.

[5] 郭清華,陸菊明,潘長玉.飲食能量對Kkay及Kk小鼠2型糖尿病發病的影響[J].軍醫進修學院學報,2005,26(2):104-142.

[6] 北京華阜康生物科技股份有限公司，KK鼠配合飼料：中國，ZL201110127312.5[P].2013-06 -26.

[7] 張曉娟,孫景江,田玉書,等.Ay 基因對KKP/Upj_Ay/J 小鼠繁殖性能與血糖的影響[J].中國比較醫學雜志,2006,16(10):582-584.

[8] 張曉娟,田玉書,劉云波.影響2型糖尿病動物模型KKP/Upj_Ay/J 小鼠血糖的因素[J].中國比較醫學雜志,2007,17(1):15-17.

[9] 劉曉丹,楊剛,范秋靈,等.自發性2 型糖尿病動物模型KKAy 小鼠腎臟損害的特征與演變[J].中國醫科大學學報,2011,40(2):104-106.

[10] 李娜,張周.Ⅱ型糖尿病KK-Ay/Ta 小鼠部分生物學特性分析[J].上海交通大學學報,2009,27(4):341-345.

[11] Jun-ichi Suto, Saori Matsuura, Kenkichi Imamura,etal.Genetic analysis of non-insulin-dependent diabetes mellitus in KK and KK-Ay mice[J].European Journal of Endocrinology,1998,139: 654-661.