C57小鼠LATl真核表達載體的構(gòu)建及其對Neuro-2a細胞的影響

衛(wèi)兵艷，劉田福，樊林花，劉茂林

(山西醫(yī)科大學實驗動物中心，太原 030001)

作為構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本元件，氨基酸不僅是機體的營養(yǎng)物質(zhì)還是腸黏膜代謝的能量來源，其參與細胞內(nèi)很多重要的代謝途徑。但氨基酸是小分子極性物質(zhì)，不能自由通過細胞膜，其要發(fā)揮各種功能首先需要進行跨膜轉(zhuǎn)運。而要實現(xiàn)氨基酸的跨膜轉(zhuǎn)運就必須依賴細胞膜上特殊的轉(zhuǎn)運載體( 氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運蛋白)來介導。目前發(fā)現(xiàn)的氨基酸轉(zhuǎn)運載體約有15種以上[1]，根據(jù)底物(氨基酸)的性質(zhì)的不同，可以將氨基酸轉(zhuǎn)運載體分為堿性、酸性和中性氨基轉(zhuǎn)運載體，根據(jù)Na+依賴性分為Na+依賴性和Na+非依賴性轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。L氨基酸轉(zhuǎn)運載體1( lamino acid transporter 1，LAT1)是中性氨基酸轉(zhuǎn)運載體中的重要成員，屬于Na+非依賴性氨基酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，主要負責轉(zhuǎn)運大的、支鏈的、芳香族的中性氨基酸，包括一些必需氨基酸，如亮氨酸等[2]。其功能調(diào)控對機體細胞代謝，生命器官功能維護具有重要的生理意義。研究發(fā)現(xiàn)[3]，在惡性腫瘤增殖中，LAT1呈過表達，可以促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移。LAT1在醫(yī)學、營養(yǎng)等生命科學領(lǐng)域也有著重要的價值[4]。Neuro-2a細胞形似神經(jīng)樣干細胞，具有一定的神經(jīng)內(nèi)分泌功能，是來源于Albino A系小鼠的自發(fā)神經(jīng)母細胞瘤。目前主要在實驗室培養(yǎng)該細胞系作為體外病理研究的細胞模型[5]。本實驗選用Neuro-2a作為細胞模型，通過構(gòu)建LAT1基因的真核表達載體，轉(zhuǎn)染Neuro-2a細胞，初步研究LAT1對Neuro-2a細胞增殖及凋亡的影響，旨在為更深入研究LAT1在腫瘤細胞中的作用及其生物學功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 8周齡SPF級雄性 C57BL/6J小鼠來自山西醫(yī)科大學實驗動物中心，生產(chǎn)許可證【SCXK(晉)2009-0001】，SPF級實驗動物使用許可證【SYXK(晉)2009-0004】。

1.1.2 細胞及載體 Neuro-2a細胞，pcDNA3.1質(zhì)粒等均由本實驗室保存。

1.1.3 其他試劑 DNA maker，RNA提取試劑盒，質(zhì)粒提取試劑盒，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，限制性內(nèi)切酶等均購于TaKaRa公司；脂質(zhì)體LipfectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自invitrogen 公司；LAT1單克隆抗體，β-actin單克隆抗體購于美國Santa Cruz公司；PCR引物及質(zhì)粒測序由 TaKaRa公司完成；MTT購自美國sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 C57小鼠LAT1全長基因片段的擴增

1.2.1.1 設計引物

利用primer premier5.0設計引物，根據(jù) GenBank(GI: 6906726)中公布的C57小鼠LAT1基因序列，編碼區(qū)全長共1539 bp，引入NotI和XhoI酶切位點，序列為(斜體為保護堿基，下劃線為酶切位點)5′引物：TTGCGGCCGCAACCGAGAGCATGG CGGTCG3′引物：CCGCTCGAGCGGAGCACGGCA GCACCCAGG，由TaKaRa公司合成。

1.2.1.2 RT-PCR擴增LAT1全長基因序列

參照RNA提取試劑盒說明提取C57小鼠腦組織總RNA，以總RNA為模板進行RT-PCR擴增cDNA。然后以cDNA為模板，進行PCR，條件為：預變性94℃ 5 min，94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 1 min，共30個循環(huán)。最后72℃再延伸5 min，終止反應。PCR擴增產(chǎn)物1.2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察電泳結(jié)果。

1.2.2 pcDNA3.1-LAT1真核表達載體的構(gòu)建

膠回收純化PCR的目標片段產(chǎn)物，加A后，先和pMD18-T載體鏈接，構(gòu)建pMD18-T-LAT1克隆載體，NotI和XhoI雙酶切鑒定。然后將pMD18-T-LAT1和pcDNA3.1載體分別用NotI和XhoI進行酶切，回收預定片段，進行連接。體系:LAT1目的片段2 uL，載體1 uL，反應液 5 uL，共計10 uL的連接體系于16℃過夜，然后轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞，涂布于含氨芐的LB平板培養(yǎng)基上，37℃恒溫過夜培養(yǎng)，挑取白色單克隆，按質(zhì)粒提取試劑盒說明提質(zhì)粒后，NotI和XhoI雙酶切鑒定，酶切正確的質(zhì)粒送TaKaRa公司進行測序。

1.2.3 pcDNA3.1-LAT1轉(zhuǎn)染Neuro-2a細胞

1.2.3.1 pcDNA3.1-LAT1瞬時轉(zhuǎn)染Neuro-2a細胞

先將Neuro-2a細胞從液氮罐中快速取出于37℃恒溫進行復蘇，然后傳代。待細胞融合度達80%以上進行轉(zhuǎn)染，按每孔分別加4.0 μg質(zhì)粒(pcDNA3.1-LAT1或pcDNA3.1)及10 μL脂質(zhì)體計算，取適量的質(zhì)粒及脂質(zhì)體進行混合，室溫靜置20 min。棄去各孔內(nèi)舊培養(yǎng)液，然后用平衡DMEM/F12培養(yǎng)基沖洗兩次，將質(zhì)粒及脂質(zhì)體混合液按組分別加入各孔內(nèi)。具體分組：選取4孔作為陽性組(pcDNA3.1-LAT1質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染)，標記為第①、②、③和④；另任選4孔為對照組(pcDNA3.1質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染)，標記為第⑤，⑥，⑦和⑧；其余孔設為空白組(不含質(zhì)粒，只含脂質(zhì)體的培養(yǎng)基)并標記為*。于37℃，5% CO2無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。吸棄舊培養(yǎng)基及混合物，加入1 mL新鮮完全培養(yǎng)基后，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24～48 h。

1.2.3.2 建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Neuro-2a細胞系

瞬轉(zhuǎn)后48 h，實驗組、對照組及空白組的每孔細胞分別加入500 ng/μL G418的完全培養(yǎng)基進行篩選。用胰蛋白酶消化Neuro-2a細胞，使細胞密度達1×103/mL，取2 mL細胞懸液置于無菌培養(yǎng)皿中，在倒置顯微鏡下，用自制的毛細吸管逐個吸出單細胞分別置于含適量新鮮完全培養(yǎng)基的96孔培養(yǎng)板中。37℃，5% CO2無菌培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。等到細胞長到96孔培養(yǎng)板的孔底1/3～1/2面積時，每孔加入200 ng/μL的G418繼續(xù)加壓篩選6～7 d。倒置顯微鏡鏡下觀察，挑選生長良好的細胞轉(zhuǎn)種于24孔板進行擴大培養(yǎng)。

1.2.4 LAT1在細胞中表達的檢測

1.2.4.1 LAT1基因mRNA水平的檢測

細胞計數(shù)后4℃，8000 r/min離心2 min，收集沉淀。按每1×107個細胞加入2 mL的TRIzol并參照試劑說明提取總RNA，并用紫外分光光度計對RNA純度和濃度進行鑒定。然后參照TakaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，用內(nèi)參及LAT1引物做 RT-PCR，檢測Neuro-2a細胞中LAT1基因在mRNA水平的表達。

1.2.4.2 LAT1蛋白表達水平的檢測

細胞裂解液充分裂解Neuro-2a細胞，12000 r/min離心3 min，提取總蛋白，于紫外分光光度計上測OD值，計算蛋白含量。上樣30 μg總蛋白、12%SDS-PAGE分離后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，蛋白干粉封閉液封閉1 h，棄TBST，加新鮮配制的一抗(LAT1一抗稀釋度為1∶250；β-actin一抗稀釋度為1：1000)，4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次5 min后，加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的鼠抗兔二抗(1∶2000)室溫孵育1 h。然后TBST再洗膜3次，每次5 min后，DAB顯色。以β-actin蛋白作參照，分析LAT1蛋白的相對表達量。

1.2.5 LAT1蛋白表達對Neuro-2a細胞增殖的影響

各組細胞分別經(jīng)EDTA-胰蛋白酶消化、離心、計數(shù)，以每孔1×103/孔的密度接種于96孔板，每組設6個重復孔，別于1t，2t，3t，4t，5t，6t(每天上午10時)進行MTT檢測。具體方法：37℃，5%C02無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)到各自時間點，于超凈工作臺內(nèi)，將各實驗孔內(nèi)加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)(析出紫色結(jié)晶)，繼續(xù)孵育充分反應4 h。小心吸棄上清后各實驗孔加入150 μL DMS0，可見紫色結(jié)晶溶解，孔板于搖床輕搖混勻后，繼續(xù)孵育10 min。最后取出96孔板置于酶聯(lián)檢測儀測試臺，于570 nm波長下檢測各孔溶液的OD值。檢測結(jié)果以空白孔調(diào)零，以時間為橫坐標，OD值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.2.6 LAT1對Neuro-2a細胞周期的影響

各組細胞復蘇后，等到達80%融合度以上，以1×103/孔的密度接種于24孔板，每組分別設4個重復孔。37℃，5%C02無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約48～72 h。37℃預平衡的胰蛋白酶消化，1000 r/min離心2 min，收集細胞沉淀，用1 mL PBS漂洗兩次。再次離心收集細胞沉淀(每管約含2～3萬個細胞)，然后每管加入由200 μLPI染料和200 μL打孔劑組成的染色液0.5 mL，排序后室溫避光孵育30 min以上。細胞染色后1 h內(nèi)，借助流式細胞儀進行檢測，分析細胞周期及凋亡的變化。

1.2.7 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS13.0進行統(tǒng)計學分析，P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義；圖表則采用SigmaPlot10.0軟件進行繪制分析。

2 結(jié)果

2.1 瞬轉(zhuǎn)后各組LAT1mRNA水平的檢測結(jié)果

凝膠圖像分析系統(tǒng)進行條帶光密度掃描，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染48 h后細胞中LAT1表達量最多，以 GAPDH 為內(nèi)參對LAT1相對表達量進行分析，轉(zhuǎn)染后48 h與其他時間點LAT1的表達量以及與對照組LAT1表達量具有顯著差異(P< 0.05)，以對照組(空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染)48 h細胞中LAT1表達量與空白組(未轉(zhuǎn)染)表達量差異沒有統(tǒng)計學意義(P> 0.1)(圖1)。

注：1轉(zhuǎn)染24 h；2轉(zhuǎn)染48 h； 3轉(zhuǎn)染72 h；4轉(zhuǎn)染96 h；5 對照組；6 空白組。

2.2 穩(wěn)轉(zhuǎn)后LAT1 mRNA水平的檢測結(jié)果

以GAPDH 為內(nèi)參(250 bp)，經(jīng)RT-PCR 對實驗組、對照組及空白組的LAT1(1550 bp)進行檢測，通過凝膠圖像分析軟件對目的片段和內(nèi)參進行灰度分析，比值見圖2，實驗組和后兩者比差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)，對照組和空白組差異沒有統(tǒng)計學意義。

2.3 LAT1蛋白水平表達的檢測結(jié)果

Western-blot檢測結(jié)果顯示:在轉(zhuǎn)染的Neuro-2a細胞中表達的LAT1蛋白可以被LAT1單克隆抗體特異性識別，大小與預期相同，相對分子質(zhì)量約為55×103。以β-actin為內(nèi)參各組的相對表達量(圖3)，且實驗組表達量高于對照組及空白組。

2.4 LAT1表達對Neuro-2a細胞的增殖影響

MTT法檢測細胞的增殖，繪制細胞生長曲線，發(fā)現(xiàn)實驗組Neuro-2a細胞增殖比對照組細胞增殖快，差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)。

2.5 LAT1表達對Neuro-2a細胞周期分析

通過流式細胞儀檢測各組Neuro-2a細胞周期，結(jié)果顯示實驗組GO/Gl期的細胞數(shù)明顯低于對照組，而S和G2/M期的細胞數(shù)增加，說明LAT1有促進Neuro-2a細胞增殖的作用。

2.6 LAT1對Neuro-2a細胞的凋亡分析

從二維散點圖結(jié)果可以看出，LAT1能抑制細胞的凋亡。

注：1對照組；3 空白組；5 實驗組；2.4.6 內(nèi)參。

注： 1.2.3 不同時間實驗組；4對照組；5空白組。

注：與對照組比較，*P < 0.05,**P < 0.01。

表2 各組細胞周期G1，G2和S的比例

圖4 各組細胞1-6d的生長曲線

注：A，對照組；B，實驗組。

3 討論

氨基酸作為營養(yǎng)物質(zhì)進出細胞，必須依賴于氨基酸轉(zhuǎn)運載體來介導。如果氨基酸轉(zhuǎn)運過程出現(xiàn)異常將會導致嚴重的氨基酸吸收和代謝障礙性疾病[6]。同時腫瘤細胞在增殖、遷移、侵襲的過程中也需要大量的氨基酸提供營養(yǎng)，氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運載體則為氨基酸進出腫瘤細胞提供了載體。可見氨基酸轉(zhuǎn)運載體在氨基酸轉(zhuǎn)運過程中具有重要的生理及病理意義[7-9]。L型氨基酸轉(zhuǎn)運載l(LATl)是腸上皮細胞中非常重要的中性氨基酸轉(zhuǎn)運載體，其除轉(zhuǎn)運支鏈氨基酸、芳香族氨基酸、中性氨基酸還有一些必需氨基酸外，同時還參與轉(zhuǎn)運如左旋溶肉瘤素等抗腫瘤藥物、左旋多巴類抗帕金森藥物以及多巴酚丁胺等抗癲癇藥物[2，10-12]。LATl作為一種為氨基酸進出細胞提供中介的載體已經(jīng)逐步被人們所認識。目前，對LATl的研究主要集中在載體的轉(zhuǎn)運特性及生理特性、蛋白表達與結(jié)構(gòu)等方面，而對轉(zhuǎn)運體的調(diào)控機制方面還涉足很少，且其生物學功能調(diào)節(jié)的分子機制目前尚未完全闡明，尤其在腫瘤治療方面的價值還需要進一步探索。本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1- LAT1質(zhì)粒的Neuro-2a 細胞具有LAT1的生物學轉(zhuǎn)運活性，且LAT1蛋白的表達能促進Neuro-2a細胞增殖，同時抑制細胞凋亡的發(fā)生。提示可否通過抑制LAT1的功能來抑制腫瘤的增殖呢？為下一步的研究提供了新的思路。本實驗從細胞水平研究了LATl在腫瘤細胞中的表達及對腫瘤細胞的影響，為研究LAT1在腫瘤中的作用奠定基礎。這對于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及治療方面都有著重要的意義。

參考文獻：

[1] Chino M,Mikami T,Yoshida T,etal．High expression of L-type amino acid transporter l(LAT1)in gastric carcinomas：comparison with non-cancerous lesions[J]．Pathol Int,201l,6l(5)：281-289．

[2] 黃士隋.氨基酸轉(zhuǎn)運載體LATl在腫瘤中的研究進展[J].臨床腫瘤學雜志,2012,17(1)：85-88.

[3] Youland RS,Kitange GJ,Peterson TE,etal. The role of LAT1 in (18)F-DOPA uptake in malignant gliomas[J].J Neurooncol,2013,111(1):11-8.

[4] Pinho MJ,Cabral JM,Silva E,etal. LAT1 overexpression and function compensates downregulation of ASCT2 in an in vitro model of renal proximal tubule cell ageing[J].Mol Cell Biochem,2011,349(1-2):107-16.

[5] 羅揚拓,朱承睿,武元,等.噬菌體展示技術(shù)發(fā)展.現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2011,11(12):2389-2390.

[6] Fan X,Ross DD,Arakawa H,etal. Impact of system L amino acid transporter 1 (LAT1) on proliferation of human ovarian cancer cells: a possible target for combination therapy with anti-proliferative aminopeptidase inhibitors.[J].Biochem Pharmacol,2010,80(6):811-8.

[7] Kaira K,Sunose Y,Ohshima Y,etal. Clinical significance of L-type amino acid transporter 1 expression as a prognostic marker and potential of new targeting therapy in biliary tract cancer.BMC Cancer,2013,13(1):482.

[8] Kaira K,Oriuchi N,Takahashi T,etal. L-type amino acid transporter 1 (LAT1) expression in malignant pleural mesothelioma[J].Anticancer Res,2011,31(12):4075-82.

[9] Peura L,Malmioja K,Laine K,etal. Large amino acid transporter 1 (LAT1) prodrugs of valproic acid:new prodrug design ideas for central nervous system delivery[J].MolPharm,2011,8(5):1857-66.

[10] Peura L,Malmioja K,Huttunen K,etal. Design,synthesis and brain uptake of LAT1-targeted amino acid prodrugs of dopamine[J].Pharm Res,2013,30(10):2523-37.

[11] Ohkawa M,Ohno Y,Masuko K,etal. Oncogenicity of L-type amino-acid transporter 1 (LAT1) revealed by targeted gene disruption in chicken DT40 cells: LAT1 is a promising molecular target for human cancer therapy[J].Biochem Biophys Res Commun,2011,406(4):649-55.

[12] Ohtsuki S,Yamaguchi H,Kang YS,etal. Reduction of L-type amino acid transporter 1 mRNA expression in brain capillaries in a mouse model of Parkinson's disease[J].Biol Pharm Bull,2010,33(7):1250-2.