APP/PS1雙轉基因小鼠認知功能和實時步態行為的相關性

張勝威，董世芬，武 汀，靳洪濤，孫建寧

(1． 北京中醫藥大學中藥藥理系，北京 100102；2． 中國醫學科學院北京協和醫學院藥物研究所新藥安全評價研究中心，北京 100050)

隨著老年人口數量的逐年上升，老年性癡呆的發病率也呈獻出逐年升高的趨勢。據不完全統計，2013年我過老年癡呆老年癡呆(alzheimer’s disease，AD)患者數量大約在500萬，并且在65歲以上的老人中，每增加5歲，患病率將增加一倍。老年癡呆患者主要表現為學習記憶能力的減退，到晚期還可能有性格的改變。但是除了這些主要的癥狀外，人們很少注意到老年癡呆的患者還有其他的行為學改變，如走路不穩，步幅不均一，摔倒的概率是非老年癡呆患者的2倍[1]。究其原因還不完全清楚，可能與癡呆患者神經功能的退化，支配運動的神經元功能減退有關。已有學者提出這樣的假設：之所以認知功能的障礙和步態的改變經常同時出現，是因為支配這兩種行為的神經基礎是一樣的。也就是說支配步態行為的神經功能損傷了，就會出現認知功能的障礙[11]。但是在臨床前研究藥物時，如何檢測動物這種行為改變的方法也是受限的。尋找一種能夠精確檢測動物的這種行為學改變的儀器設備是首要的。目前我們有了GAS-2大小鼠步態分析儀，這是一種專門檢測大小鼠步態行為的儀器，這樣就能夠檢測到一些肉眼無法觀測到的結果[2]。

目前關于臨床上AD患者的步態異常有很多報道[3-4]，但是在動物模型上關于AD步態行為的改變還未見報道。APP/PS1雙轉基因小鼠是目前與人類AD發病機制最為接近的模型動物，下面我們就APP/PS1小鼠的步態行為學改變做一下初步探索，以及兩種行為學的改變有無相關性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：健康SPF級APP/PS1雙轉基因AD模型小鼠16只，購自北京華阜康生物科技股份有限公司(SCXK(京)2009-0004)。正常對照組選用C57/BL6J小鼠，14只，雌雄各半，3月齡，體重20～22 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司(SCXK(京)2009-0007)。飼養于北京中醫藥大學屏障環境實驗動物室，許可證號：SYXK(京)2011-0024， 12 h明暗交替。

1.1.2 主要藥品：石杉堿甲片(雙益平)，白色片劑，上海復旦復華藥業有限公司生產，批號121001，成人用量是每天6片(50 μg/片)，實驗用量是50 μg /kg(相當于60 kg成人用量的10倍)，用前以去離子水配成所需濃度。

1.1.3 主要儀器：Morris水迷宮(MWM)，中國醫學科學院藥物研究所提供。GAS-2大小鼠步態分析系統，由北京鑫海華儀科技有限公司生產。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及給藥

APP/PS1雙轉基因AD模型小鼠16只，雌雄各半，分到模型(model)組、石杉堿甲片(Huperzine A)組，每組8只。C57/BL6J 小鼠14只放入正常對照(control)組。在小鼠3月齡時開始給藥，連續給藥150 d。給藥劑量為1 mL/100g體重。模型組和正常對照組分別給予相應體積的生理鹽水。給藥結束后，進行水迷宮和步態行為學檢測。

1.2.2 水迷宮檢測方法

首先將平臺放入第一象限中間，平臺離池壁大約22 cm。向池中加水，水深大概淹沒平臺1 cm。再將20 g鈦白粉加入到水中，充分混勻，使池中水的顏色成白色，與動物有明顯的對比。水溫22 ± 0.5 ℃，實驗室溫度保持25 ℃。訓練期間環境安靜，迷宮外參照物保持不變。

試驗包括：(1) 定位航行試驗：實驗歷時4 d。受試動物每天分別從除第一象限外的三個象限入水，依次進行訓練，將小鼠面向池壁放入水中，記錄找到平臺的時間，并在臺上停留5 s，記為逃避潛伏期。測試時限定為90 s，超過90 s者，逃避潛伏期以90 s計。并將動物引導至平臺，在臺上停留30 s。檢測小鼠對平臺空間位置記憶的保持能力。(2)空間探索實驗：檢測小鼠對平臺空間位置記憶的保持能力。行為測試第五天撤除平臺，由第三象限入水點將小鼠面向池壁放入水中，記錄其首次穿越平臺的時間(超過90 s以90 s計)、穿越原平臺相應位置的次數及在平臺所在象限的游泳時間和距離。

1.2.3 小鼠步態檢測方法

水迷宮檢測結束后的第二天進行步態行為的測試。分為兩個階段：(1)訓練：訓練方法：準備一空鼠盒，先將動物轉移該鼠盒內，將飼養小鼠的鼠盒置于步態儀后端的鼠盒托架中，以建立一個熟悉的環境。將小鼠置于步態儀前端的采樣跑道上，并且從動物后方給相應刺激直至動物跑完全程，并進入分析儀后端暗箱中，并且堵上暗箱入口，讓該動物在其中適應30 s，如果動物適應完暗箱環境后沒有從暗箱的出口跳入下方的飼養鼠盒內，可以人為將動物置于該鼠盒中，適應1 min，這樣算是完成一次訓練。取出鼠盒，準備下一只。按照此種方法完所有動物的訓練，完成一輪訓練。第一天訓練時，大概每只動物需要3 min時間，以后會逐漸加快。每只動物每天訓練3次，連續訓練7 d，直至所有的動物在沒有刺激的條件下可以不停頓地完成在跑道上的行走。(2)檢測：訓練結束后，進行3次實時步態行為錄像，合格的錄像要求為此次錄像中必須包含有3個連續的腳印信息，而且中間沒有停頓。之后用專用分析軟件分析，取各個指標均值。本次實驗中取了速度體態指標、支撐擺動時相指標、制動推進指數指標，各個指標的物理參數的意義見討論部分。

1.2.4 統計學方法

2 結果

2.1 APP/PS1雙轉基因小鼠學習記憶能力的改變

從測試第1天開始，模型組動物的逃避潛伏期就明顯高于正常對照組(P< 0.05)，一直持續到第4天；經過治療，石杉堿甲在第3天的時候能夠明顯減少逃避潛伏期，一直到實驗結束(P< 0.05)。其中n=14代表正常組有14只動物，n=8代表模型組和石杉堿甲組各有8只動物(表1)。

空間探索實驗中，模型組動物在目標象限停留時間、游泳路程顯著低于正常對照組(P< 0.05)，第一次穿越平臺的時間比模型組顯著增加(P< 0.05)，穿臺次數顯著減少(P< 0.05)；經過治療，石杉堿甲能夠增加目標象限時間、減少第一次穿臺時間、增加穿臺次數(P< 0.05)(表2)。

2.2 APP/PS1雙轉基因小鼠實時步態行為的改變

2.2.1 APP/PS1轉基因小鼠步態中速度體態指標的改變

與正常對照組相比，模型組小鼠平均步行速度顯著降低(P< 0.05)，平均步行周期、絕對值平均體轉角和側向移動均顯著升高(P< 0.05)。石杉堿甲能顯著提高平均步行速度，(P< 0.05)，能降低平均步行周期和減少側向移動，但沒有達到統計學差異(P> 0.05)(表3)。

2.2.2 APP/PS1轉基因小鼠步態中四足支撐時相的改變

與正常對照組相比，模型組小鼠在一個步行周期中左后足、右后足支撐時相顯著延長(P< 0.05)，石杉堿甲能顯著縮短左后足、支撐時相(P< 0.05)，降低右后足支撐時相，但是沒有統計學差異(P> 0.05)(表4)

2.2.3 APP/PS1轉基因小鼠步態中四足擺動時相的改變

與正常對照組相比，模型組小鼠在一個步行周期中左后足、右后足擺動時相顯著縮短(P< 0.05)，石杉堿甲能顯著延長左后足支撐時相(P< 0.05)，能降低右后足支撐時相，但沒有統計學差異(P> 0.05)(表5)

表1 APP/PS1小鼠水迷宮逃避潛伏期的改變

表2 APP/PS1轉基因小鼠水迷宮空間探索實驗結果的改變

表3 APP/PS1轉基因小鼠步態中速度體態指標的改變

表4 APP/PS1轉基因小鼠步態中四足支撐時相的改變

表5 APP/PS1轉基因小鼠步態中四足擺動時相的改變

2.2.4 APP/PS1轉基因小鼠步態中四足推進指數的改變

與正常對照組相比，模型組小鼠左前足、右前足、右后足推進指數均顯著增加(P< 0.05)，石杉堿甲能顯著降低左前足推進指數(P< 0.05)，降低右前足。右后足推進指數，但沒有統計學差異(P> 0.05)(表6)

2.2.5 APP/PS1轉基因小鼠步態中四足制動指數的改變

與正常對照組相比，模型組小鼠左前足、右前足右后足制動指數均顯著降低(P< 0.05)，石杉堿甲能顯著升高左前足制動指數(P< 0.05)，升高右前足、右后足制動指數，但是沒有統計學差異(P> 0.05)。

2.3 兩種行為學的相關性分析

通過相關性分析得出，最后一天動物認知功能的第一次穿臺時間與雙側前足的制動指數相關度較高(r值分別為-0.433、-0.379，P值分別為0.039和0.079)，其余步態分析指標與認知功能相關指標關系都不大(表8、9、10)

表6 APP/PS1轉基因小鼠步態中四足推進指數的改變

表7 APP/PS1轉基因小鼠步態中四足制動指數的改變

表8 認知功能與速度體態指標的關系

表9 認知功能與支撐時相指標的關系

表10 認知功能與制動指數指標的關系

3 討論

老年癡呆(alzheimer’s disease，AD)是臨床上發病率最高的癡呆類型，臨床表現主要是學習記憶能力的減退，到了后期可能還有一些性格的改變，生活無法自理，給家庭和社會帶來沉重的經濟負擔。尋找一種能夠治療AD的藥物一直是醫學工作者研究的目標。APP/PS1雙轉基因小鼠是目前與臨床上AD患者發病機制最為接近的模型動物。可能由于是轉基因小鼠品系的不同，老年斑出現的時間不一致。但是學習記憶能力減退出現時間的出入不大，大概在3～4月齡時[5]。本實驗在3月齡時開始給予藥物治療，在這一時期可能已經出現了學習記憶能力的減退。直到給藥結束時，動物8月齡，學習記憶能力有明顯的減退，表現為逃避潛伏期增加，在目標象限的停留時間和游泳路徑減少等。石杉堿甲(Huperzine A)是從石杉屬(HuperziaBernh.)植物蛇足石杉(Huperziaserrata, 又名千層塔)中提取的一種石松生物堿，前期研究表明Huperzine A是一種高效的、高選擇性的可逆性膽堿酯酶抑制劑。可以與乙酰膽堿酯酶可逆性地結合，抑制其活性，從而提高中樞乙酰膽堿的水平，并且對外周的作用不明顯[6]。還有其他的一些藥理實驗表明，Huperzine A還具有抗氧化應激[7]和抗凋亡[8]的作用。是一個潛在的治療AD的藥物。通過150 d的連續給予石杉堿甲的治療，模型動物的逃避潛伏期明顯縮短，在目標象限停留時間和目標象限的游泳距離也增加，說明石杉堿甲能夠提高APP/PS1轉基因小鼠的學習記憶能力。

學習記憶能力的減退固然是AD患者的最主要的臨床表現，但是AD患者其他功能的改變還未曾引起人們足夠的認識。早在1983年，Visser H[9]就已經注意到AD患者摔倒的概率要明顯高于非癡呆患者。并且進行更進一步的觀察，發現AD患者步長減少，步速降低，步頻減少，連續走步時的穩定性降低，雙足站立時間延長，擺動幅度增加。但是觀察到的這些只能證明AD患者的移動速度減慢，并不能說明這些改變就能說明與摔倒概率增加有必然的聯系。之后又有學者對有認知功能障礙，并且在最近一年內有摔倒的患者進行更為細致的檢測分析得出這樣的結論：摔倒的患者的步行周期和步幅的穩定性都沒有一年內無摔倒病史的老年人要高。線性回歸分析顯示步行周期的不穩定也就預示著摔倒，這個不行周期的不穩定與步幅、平行、步行速度，甚至和心情都有一定的關系[10]。以上均說明AD的患者出現步態行為的改變是很常見的。本次實驗結果也顯示APP/PS1模型鼠也有很多步態行為與正常對照組有差異。除了步行速度降低、步行周期延長與臨床AD患者的癥狀相似外，還得到了一些更為精細的參數：擺動時相、支撐時相，推進指數、制動指數等。擺動時相是指在一個步行周期中，一只腳離地到緊接著的下一個步行周期開始時著地之間的時間與該足步行周期的比值，支撐時相是指一只腳從著地開始到離開地面之間的時間與該足步行周期的比值，支撐時相和擺動時相是成完全負相關的(r=-1)；制動指數是指在一個步行周期中的支撐時相范圍內，一只足從著地時間算起到對地面的壓強最大的時間止，這段時間與該支撐時長的比值，推進指數則是指從壓強最大時間起到壓強為零止，這段時間與該支撐時長的比值，推進指數和制動指數也是成完全負相關的(r=-1)[2]。本實驗的數據顯示：隨著的步行周期的延長，后足支撐時相顯著高于對照組，這個與臨床報道相一致。模型組動物的除左后足之外的其余三足的推進指數均顯著高于正常對照組。正常對照組動物的兩側前足的推進指數與制動指數均在50%左右，后足的推進要比前足的大，這個我考慮為正常對照

組的前足是用來控制方向的，而后足是用來驅動肢體前行的，分工比較明確。而模型組動物除左后足之外的三足的推進指數均遠高于50%，可能說明動物支配四足的神經功能不夠健全，或者是有損傷，使得三足均驅動肢體前行。經過相關性分析，第一次穿臺時間與雙側前足的制動指數是呈負相關的(r=-0.433，-0.374)，且與左前足相關性顯著(P< 0.05)，這個可能是與臨床上AD患者摔倒的概率增加有關。

由于本次實驗的樣本量較小，想完全從動物身上探索步態的確切改變，還需加大樣本量，做進一步的研究。

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