缺氧對星形膠質細胞DNA甲基化及組蛋白乙酰化相關酶的表達影響

楊清麟，李 良

(首都醫科大學基礎醫學院病理學系，北京 100069)

星形膠質細胞是中樞神經系統(central nervous system，CNS)的主要支持成分，也是腦組織中最豐富的膠質細胞類型，具有調節腦內微環境和神經傳遞等重要功能，并為神經元提供營養物質和神經營養因子[1]。缺血低氧是機體常見的一種損傷因素，能量代謝的下降可引發一系列線粒體呼吸功能障礙，活性氧自由基產生過多,從而引起細胞的變性壞死。在缺氧等損傷因素刺激下，星形膠質細胞可發生活化反應，稱為反應性星形膠質細胞(reactive astrocyte)，主要表現為細胞增生、形態學改變以及相關蛋白的異常表達[2,3]。近些年來表觀遺傳學的研究成為熱點，所謂表觀遺傳學是指在DNA序列未改變的基礎上，基因功能發生可遺傳的表型改變， DNA甲基化和組蛋白修飾是表觀遺傳學研究的主要內容之一。DNA甲基化是在DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基轉移到胞嘧啶C第5位碳原子上的過程。目前認為，DNMTs家族成員至少包括DNMT1、DNMT2、DNMT3A和DNMT3B四個亞型[4]。甲基結合結構域蛋白2(methyl-binding domain 2, MBD2)則能發揮DNA去甲基轉移酶的作用。組蛋白的乙?；接山M蛋白乙?；D移酶(histone acetyltransferase，HAT)和組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)共同調節。多種具有HAT和HDAC活性的調節因子，通過對組蛋白乙?；^程的調節，在基因表達調控中發揮著重要作用。其中CREB綁定蛋白(CREB-binding protein，CBP)就是一個常見的具有HAT活性的調節因子。缺血低氧損傷是否可以通過表觀遺傳學調控機制影響反應性星型膠質細胞蛋白的表達，關于這方面的研究少有報道。本研究采用原代培養的星形膠質細胞，觀察缺氧處理對DNA甲基化和組蛋白乙?；嚓P酶表達水平的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

新生24 h內SPF級Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠(來源于北京維通利華實驗動物技術有限公司【SCXK(京)2012-0001】)，胎牛血清(杭州四季青)，DMEM/F12培養基、DMEM培養基(Gibco公司)，多聚賴氨酸(poly-L-Lysine,PLL)、核酸染料Hoechst 33258、碘化丙啶(propidium iodide, PI)(美國Sigma公司),兔抗DNMT1單克隆抗體、兔抗DNMT3A多克隆抗體、兔抗CBP單克隆抗體、兔抗HDAC3單克隆抗體(Cell Signaling公司)，兔抗MBD2多克隆抗體(Santa Cruz公司)，鼠抗β-actin單克隆抗體、HRP標記羊抗兔IgG抗體、HRP標記羊抗小鼠IgG抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)，BCA蛋白定量試劑盒和ECL發光試劑盒(Pierce公司)，GFAP、DAPI(碧云天生物技術研究所)。

1.2 方法

1.2.1 原代星形膠質細胞的培養：新生24 h內的SPF級SD大鼠，冷凍麻醉, 75%乙醇消毒，斷頭，取出兩側大腦半球置于冰的PBS中，在體視顯微鏡下剝離腦膜并分離出大腦皮質，剪碎后加入適量胰酶37℃消化5 min，終止消化后小心吹打，經200目篩網濾過, 將濾液離心5 min(1000 r/ min)，棄上清，將用含10%胎牛血清DMEM/ F12培養基重懸后的懸液接種至培養瓶中，差速貼壁1 h后將上清離心5 min(1000 r/ min), 重懸后接種于用多聚賴氨酸預處理的培養瓶中。每2～3 d換液1次, 待第9～14天左右細胞長滿后，固定于恒溫搖床(37℃, 250 r /min)震蕩18 h，舍棄含脫落細胞的細胞懸液，以去除少突膠質細胞和小膠質細胞，PBS清洗后消化傳代，第三代細胞用細胞免疫熒光法標記神經膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)檢測星形膠質細胞純度在95%以上，可以使用。

1.2.2 缺氧處理：培養細胞分為對照組和缺氧模型組。缺氧模型組的細胞進行氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation，OGD)處理，將正常培養的星形膠質細胞棄掉原培養液，PBS沖洗兩遍，加入5%胎牛血清，2.78 mmol/L葡萄糖的DMEM培養基后，放入37℃，2% O2，5% CO2，85%濕度條件下分別培養24 h，48 h和72 h。

1.2.3 Western blot檢測：收集細胞后加入全細胞裂解液提取蛋白，13000 r/min, 離心10 min后取上清液，BCA法測定蛋白濃度并制備電泳蛋白樣品，分別用8%或10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質，電泳后將PAGE凝膠中的蛋白質電轉移至硝酸纖維素膜上，用脫脂牛奶室溫封閉1 h后分別加入一抗DNMT3A(1∶1000 ), DNMT1(1∶1000 ), MBD2(1∶200 ), CBP(1∶1000),HDAC3 (1∶1000 )，4℃過夜。TTBS沖洗后，加入辣根過氧化物酶標記的相應二抗，室溫孵育1 h加入ECL發光試劑后在暗室曝光。所得X-線膠片用Gel-Doc凝膠成像系統掃描，應用ImageJ分析軟件對各組條帶進行半定量分析，計算各蛋白條帶總吸光度A值與相應內參總吸光度A值的比值。

1.2.4 細胞活性測試：原代培養第三代的星形膠質細胞分別缺氧處理24 h，48 h，72 h后，吸去原培養基，PBS浸洗3次，加培養液和Hoechst染液(Hoechst 染液終濃度為5 μg/mL), 37℃, 5%CO2孵箱中孵育15 min后取出, PBS液洗滌3次, 加PBS液和PI染液((PI染液終濃度為10 μg/mL), 室溫靜置10 min, PBS洗滌，熒光顯微鏡下觀察，照像，每個小皿在40倍視野下隨機計數10個視野，每組計數4個小皿，計算死亡細胞百分比(細胞死亡率=死亡細胞數/所有細胞數*100%)。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 原代培養星形膠質細胞鑒定

培養星形膠質細胞經兩次傳代后，用小鼠抗GFAP(glial fibrillary acidic protein,膠質纖維酸性蛋白，被普遍認為是星形膠質細胞的標志物)的單克隆抗體進行細胞免疫熒光染色，經過鑒定證實為星形膠質細胞，陽性率達95%以上(彩插8圖1)。

2.2 細胞活性檢測

采用Hoechst33258/PI雙染檢測細胞活性，PI標記壞死的細胞(圖2中紅色熒光所示)，Hoechst33258標記所有的細胞核(圖2中藍色熒光所示)。星形膠質細胞缺氧24 h后，對細胞活性沒有明顯影響，細胞死亡率僅從對照組的1.5%(彩插8圖2A)增加到2.3%(彩插8圖2B)；細胞缺氧48 h后，細胞死亡率為4.7%(彩插8圖2C)，與對照組相比有統計學意義，證明這時缺氧對細胞造成了一定的損傷；細胞缺氧72 h后，細胞死亡率與對照組相比差異性顯著，達到8.6%(彩插8圖2D)。

2.3 DNA甲基化相關酶的表達

星形膠質細胞經缺氧處理48 h后，DNA甲基轉移酶DNMT3A、DNMT1的表達分別比對照組增加了49%和83%，而去甲基轉移酶MBD2的表達比對照組減少了36% (圖3)。

2.4 組蛋白乙?；嚓P酶的表達

星形膠質細胞經缺氧處理48 h后，組蛋白去乙酰化酶HDAC3的表達增高，為對照組的2.1倍，而組蛋白乙?；傅谋磉_顯著上升，增高至對照組的20倍(圖4)。

3 討論

越來越多的研究顯示，缺血低氧性腦損傷可誘導星形膠質細胞異常蛋白的表達，在疾病發生發展過程中發揮重要的作用[5-8]，那么表觀遺傳學機制是否參與蛋白表達的調控？本實驗結果顯示，原代培養的星形膠質細胞經缺氧處理48 h后，DNA甲基轉移酶DNMT1和DNMT3A表達水平增高。 DNMT1是1955年Bestor等[9]從真核生物中克隆出來的第一個DNA甲基轉移酶，它的主要作用是維持原有DNA 甲基化，這種維持作用可以將DNA甲基化信息傳遞給子代細胞, 并且在細胞分裂過程中起最主要的穩定維持甲基化狀態的作用[10-11]。DNMT3又稱從頭甲基化酶，在未甲基化的基因組序列中催化CpG二核苷酸甲基化[12]。本實驗中發現兩種DNMT水平均有升高，提示缺氧不僅可以維持原有DNA甲基化水平，同時還可以誘導新位點發生甲基化。DNA甲基化的發生和甲基化程度的高低取決于DNMTs及去甲基轉移酶的表達，本實驗中星形膠質細胞缺氧后DNMT表達增高的同時DNA去甲基轉移酶表達水平下降，提示缺氧可誘導星形膠質細胞DNA甲基化水平的增高。目前關于缺氧誘導星形膠質細胞DNA甲基化水平改變尚無報道，而關于其它細胞缺氧及腦組織缺氧后的DNA甲基化水平及相關酶的改變，研究結果報道也并不一致。Jae-Chul L等[13]對沙鼠進行腦缺血處理，發現DNMT1在海馬CA1區的表達下降；Yoka A等[14]使用Hela細胞進行缺氧實驗，顯示DNA甲基轉移酶和去甲基轉移酶活性均沒有改變，缺氧也未影響其全基因組甲基化水平；Ying W等[15]使用大鼠腦組織發現缺氧后DNA甲基化水平明顯升高。此外，本課題組之前采用雙側頸總動脈結扎法(two-vessel occlusion, 2-VO)制備腦血流低灌注模型，發現缺血/低氧的大鼠腦組織早期(術后10 d，30 d)全基因組甲基化水平明顯下降，而后期(術后90 d，180 d)又明顯升高。

注：A為蛋白印跡圖；B為蛋白表達量統計圖；*示差異有統計學意義：P < 0.05。

注：A為蛋白印跡圖；B為蛋白表達量統計圖；*示差異有統計學意義P<0.05；**示統計學差異有顯著性P<0.01。

缺氧對組蛋白乙?；降挠绊懸灿幸恍┫嚓P報道，Annamaria L等[16]采用原代培養的小鼠大腦皮層神經元進行氧糖剝奪處理，發現組蛋白H3的乙?；浇档停籋uaping S等[17]用原代培養的大鼠心肌細胞進行急性缺氧處理，發現HAT活性升高，而HDAC在急性缺氧1 h時明顯活性升高，缺氧4 h后又比急性缺氧1 h時有所下降，組蛋白H3的乙酰化水平升高；Qin L等[18]使用細胞系進行缺氧處理后發現組蛋白H4的乙酰化水平也有所降低。本實驗結果顯示缺氧后HDAC表達雖有增高，但HAT的增高卻更加明顯。HAT通過在組蛋白N端賴氨酸殘基引入乙酰基，使其乙?；?，激活轉錄基因從而促使基因表達，而HDAC則通過使組蛋白去乙?；瘉硪种苹蜣D錄。組蛋白乙?；腿ヒ阴；c基因的表達調控密切相關，HAT和HDAC之間的動態平衡控制著染色質的結構和基因的表達。本實驗中HAT表達的增高是HDAC增高水平的將近10倍，可能促進某些基因的表達，在缺氧性腦損傷中發揮相應的作用。

本實驗結果發現缺氧后星形膠質細胞DNA甲基化水平升高，組蛋白乙酰化水平也同時升高。DNA甲基化會抑制基因的表達，而組蛋白乙?；纱龠M基因的表達，這兩組結果看似矛盾。事實上基因組甲基化水平并不能夠代表某個特殊基因甲基化水平，如老年人常表現有基因組的低甲基化，然而腫瘤病患者卻有某些抑癌基因的高甲基化；同樣組蛋白的修飾除乙?；猓€有甲基化、泛素化、磷酸化等修飾方式綜合調控基因的表達。因此，針對某一特定基因的表達，還應綜合各方面因素全面考慮。

以上結果表明，缺氧可以影響星形膠質細胞DNA甲基化和組蛋白乙酰化相關酶的水平，并可能引起表觀遺傳學的改變，影響相關基因的表達，從而在缺血性腦損傷中發揮作用。

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