H1N1流感與H7N9禽流感感染BALB/c小鼠發病特點初步研究

楊玉琴，徐春華，朱召芹，田 棣, 陳麗香，楊 華, 秦波音，宋志剛，管文彩，劉 祎，蔡家麟，周曉輝，周文江,2

(1.上海市公共衛生臨床中心，上海 201508； 2.復旦大學藥學院， 上海 201203)

正粘病毒科禽流感血細胞凝集素神經氨酸酶流感人類禽流感H7N9亞型禽流感病毒是一種最近出現的新型H7N9禽流感病毒，其跨宿主在人類進行傳播，既往僅在禽間發現，未發現過人的感染情況[1-2]。H7N9新型流感病毒是由三個已知禽流感病毒部分重組獲得[3]。截至2013年5月31日，中國內地共報告131例確診病例，其中康復78人，在院治療14人，死亡39人[4]。雖目前病例仍處于散發狀態，但目前仍無法排除其再次爆發的可能。最近研究結果顯示H7N9禽流感病毒具備“有限的人際傳播能力”，因此逐漸適應中的H7N9禽流感病毒極有可能在未來發生大流行[5-6]。

本實驗室前期研究中發現，從患者分離的H7N9流感病毒可以成功感染小鼠甚至導致小鼠死亡，但由于H7N9流感病毒必須在生物安全三級實驗室進行，嚴重影響了對它的致病機制的揭示。同時，在對H7N9的了解相對較少的情況下，需要借助目前在致病機制和治療研究較為深入的普通流感來對H7N9進行比較探討。因此對于禽流感H7N9和普通流感發病特點的比較研究極為迫切，這將為禽流感H7N9的發病機制、藥物和疫苗的研究提供線索。

1 材料和方法

1.1 病毒

選擇H1N1病毒株A/Puerto Rico/8/34(H1N1)(以下簡稱H1N1 PR8)和H7N9病毒株 A/Shanghai/4664T(H7N9)(以下簡稱H7N9)為研究對象，H7N9和 H1N1 PR8為本實驗室保存。A/Shanghai/4664T為H7N9患者分離株。病毒經MDCK細胞和雞胚培養滴定后，-80℃儲存備用，實驗均在動物生物安全三級實驗室(ABSL-3)中進行[高致病性病原微生物實驗室資格證書編號為衛BSL3-007;中國合格評定國家認可委員會實驗室認可證書編號為NO.CNAS BL0016]，實驗方案經過本單位動物倫理委員會審查。

1.2 動物

實驗動物均選用SPF級雌性BALB/c小鼠，6～8周齡 (體重18～20 g)。購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[SCXK(滬)2008-0016]。

1.3 感染方案

將BALB/c小鼠隨機分為3組，即H1N1 PR8感染組、H7N9感染組和PBS對照組，每組10只，每籠5只，標記后分別稱重。小鼠經七氟烷輕度麻醉后，滴鼻感染小鼠，每只小鼠感染病毒或PBS的量為50 μL，病毒劑量為5×103TCID50/只，置獨立送風隔離籠具(IVC)中正常飼養，逐日觀察小鼠發病情況，記錄體重及大體變化。

1.4 動物取材

每日觀察感染小鼠的活動狀態及臨床表現，稱量體重，每組感染小鼠分別于感染后第3天和第7天脫臼處死，每組每個時間點處死3只，剩余小鼠繼續觀察體重及死亡情況。處死后小鼠取其肺臟，取左上肺葉于組織裂解液中用于提取組織RNA；左肺下葉于4%多聚甲醛溶液中固定，剩余肺葉于凍存管置-80%冰箱中備份保存。

1.5 肺組織總RNA提取及PCR檢測

使用Total RNA抽提試劑盒 (QIAGEN，美國)抽提組織中的總RNA，抽提產物用微量分光光度計(Nanodrop 1 000, 美國)測定核酸濃度(OD260/OD280)后，加 RNAase-free DNAse I 37℃ 放置20 min，然后 65℃ 放置10 min。純化后的樣本用One-step RT-PCR kit(TaKaRa，大連寶生物)進行檢測，擴增體系為25 μL：12.5 μL TaqMan PCR基礎液，400 nmol/L引物和300 nmol/L TaqMan探針，2.5 μL RNA模板。將96孔板子放入熒光定量PCR儀(Eppendorf Master cycler eprealplex,德國)。擴增程序: 42℃ 10 min；95℃1 min；95℃ 15 s，60℃ 45 s，45個循環。

表1 H1N1 PR8 和H7N9引物序列

1.6 肺組織病理檢測

取小鼠肺組織，4%多聚甲醛溶液固定，常規石蠟包埋，HE染色，光鏡下觀察其病理變化。

1.7 統計學方法

小鼠的體重變化(weightinfected day-weight0 day/weight0 day×100%)，肺指數(weight of lung ×100/bodyweight)。用統計學軟件GraphPad Prism Software 5.0對組間差異應用t檢驗分析。

2 結果

2.1 小鼠感染后癥狀及大體觀察

正常PBS組小鼠皮毛光澤，反應靈敏，飲食飲水正常，活動正常，體重增長。H1N1 PR8感染組和H7N9感染組小鼠于感染后第2天體重開始下降，感染后第3天開始出現豎毛、聚集成堆、反應遲鈍、呼吸急促、食欲減退以及活動度下降嚴重。H1N1 PR8感染組小鼠在感染后第5天開始死亡，對照組小鼠未見異常。在感染后7 d內PBS組小鼠體重逐漸升高，H1N1 PR8組和H7N9組逐漸減低，H1N1 PR8組較H7N9組降低更為明顯，H1N1 PR8感染組在第7天降到30%以上，H7N9感染組降到20%以上(圖1)；H1N1 PR8感染組和H7N9感染組小鼠在感染后第7天肺指數較第3天高，PBS對照組無顯著變化。感染后3 d H1N1 PR8組小鼠肺指數與H7N9組和PBS組相比顯著增高(P<0.05)，感染后7 d H1N1 PR8感染組和H7N9感染組小鼠肺指數較PBS對照組相比顯著增高(P<0.05)(圖2)。

2.2 感染小鼠肺組織病毒載量測定

感染后的各組小鼠，于感染第3天和第7天處死，取肺組織勻漿上清進行病毒載量分析。結果顯示PBS組檢測陰性，未檢出病毒。H1N1 PR8感染組和H7N9感染組檢測均為陽性，其病毒載量在感染后第3天均為最高，第7天均降低，H1N1 PR8感染組降低顯著(P<0.05)，H7N9感染組降低不明顯(P>0.05)。H1N1 PR8感染組和H7N9感染組小鼠病毒載量在感染后第3天無顯著差異，第7天H7N9感染組顯著高于H1N1 PR8感染組 (P<0.05)。

注： *P<0.05，**P<0.01。

2.3 感染小鼠病理組織學觀察

2.3.1 肉眼觀察

正常對照組小鼠肺臟呈淡粉紅色，質地柔軟，肺葉表面光滑潤澤，無充血區。H1N1 PR8感染組和H7N9感染組均出現不同程度的肺臟病理改變，充血現象明顯，呈現暗褐色外觀，肺重增加。感染后3 d H1N1 PR8感染組小鼠肺臟病變面積達10%，H7N9感染組小鼠未見顯著病變，感染后7 d H1N1感染 PR8感染組小鼠病變面積達95%以上，H7N9感染組小鼠病變面積只有80%左右。

2.3.2 鏡下觀察

正常對照組病理學檢查，肺間質未見炎性細胞浸潤，肺泡大小正常，無擴張及萎縮，肺泡間隔不增寬，各級支氣管上皮完整無滲出物，毛細血管無充血、出血現象，僅在小支氣管周圍有少量淋巴細胞(彩插10圖4A,D)。H1N1 PR8感染組和H7N9感染組均出現了一定程度的病理改變，在感染后3 d H1N1 PR8感染組主要改變輕度的炎癥細胞浸潤和水腫(彩插10圖4B)；H7N9感染組主要是輕度的炎癥細胞浸潤(彩插10圖4C)。在感染后7 d H1N1 PR8感染組主要改變是肺組織肺泡間隔增寬，肺內小血管及肺泡間隔的毛細血管擴張、淤血，肺泡腔不同程度縮小，出現大面積肺水腫(彩插10圖4E)；H7N9感染組主要是大量炎癥細胞浸潤，包括淋巴細胞和單核細胞的浸潤，肺泡腔不同程度縮小，小部分區域出現實變(彩插10圖4F)。

3 討論

BALB/c小鼠是流感病毒研究中使用最為廣泛的哺乳動物模型之一[7-8]，采用H1N1 PR8感染BALB/c小鼠建立流感動物模型有很多報道[9-10]，近期有H7N9成功感染BALB/c小鼠的報道[11]。本研究主要是研究在同一感染劑量下，H1N1 PR8和H7N9病毒感染后小鼠的發病特點是否存在差異。

研究結果發現H1N1 PR8和H7N9感染后小鼠在大體病變、病毒復制水平和病理病變等方面均存在一定程度的差異。從大體觀察表現來看，H1N1 PR8感染小鼠和H7N9感染小鼠在感染的7 d內體重均降低，但H1N1 PR8感染小鼠更明顯；H1N1 PR8感染小鼠的肺指數在感染后第3天的肺指數就已經增高，H7N9感染小鼠的肺指數在感染后第7天才增高。且H1N1 PR8感染小鼠在感染后第5天出現死亡，而H7N9感染小鼠未出現。病理結果也顯示在感染后第3天時H7N9感染小鼠病變較輕，總體來看H1N1 PR8感染小鼠比H7N9感染小鼠病變重。這可能最主要的原因為H1N1 PR8為國際標準的鼠適應株，小鼠對其反應比較敏感，在同等劑量下病變明顯；H7N9病毒為臨床分離株，對小鼠可以致病，但鼠適應性較差。

從病毒復制水平來看， H1N1 PR8感染小鼠病毒載量在感染后第3天達最高后，第7天顯著降低，而H7N9感染小鼠在感染后第3天達最高后，第7天沒有顯著降低。這可能是小鼠對H7N9病毒的清除能力較弱。病理結果提示H1N1 PR8感染小鼠和H7N9感染小鼠在感染的7 d病變均較為嚴重，但H7N9感染小鼠病變主要是炎癥細胞浸潤，而H1N1 PR8感染小鼠除炎癥細胞浸潤外，還有大面積的水腫。這可能是由于不同毒株觸發的小鼠免疫機制存在不同而造成的。

綜上所述，本次研究通過選用H1N1 PR8和H7N9感染BALB/c小鼠，發現小鼠在兩種不同毒株感染下均可發病，但發病特點有所差異，由于H7N9未經過鼠適應性，因此對小鼠的致病性不是很高，但在小鼠體內的復制力很強，可以保持一段很長的時間，而H1N1 PR8則是致病性很強，但病毒迅速降低。這兩種病毒不同的致病特點將為H7N9致病機制與防治的研究提供初步線索，但是相關機制仍需進一步深入研究。本研究結果提示，由于H7N9病毒對鼠的適應性比H1N1 PR8差，后續用BALB/c小鼠進行藥效和疫苗評價研究時需要考慮提高病毒滴度。

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