血液免疫學指標在過敏性紫癜大鼠和兔模型及患兒體內的比較

李彥紅，黃 瀾，朱 華，徐艷峰，隋小龍，徐玉環，韓云林，馮曉純，秦 川

(1.中國醫學科學院，北京協和醫學院，醫學實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021； 2.長春中醫藥大學附屬醫院，長春 130021)

過敏性紫癜(henoch-schonlei purpura，HSP)是一種由IgA免疫復合物沉積介導的小血管炎癥性疾病。它是最常見的兒童血管炎性疾病，據報道每年的發病率為6.1～26.5/100 000[1-2]。它的病因學不完全清楚，但是暴露于很多抗原如感染性物質、疫苗及藥物很可能會激發免疫學改變[3-4]。診斷主要是依據非血小板減少性紫癜的出現，且紫癜的部位主要位于四肢末端和臀部。其中胃腸道損傷大約占據患者1/2～2/3，其它的臨床癥狀包括關節痛或關節炎、軟組織腫脹、血尿或蛋白尿等[5]。結合過敏性紫癜患者病理改變和實驗室發現的急性期小血管壁IgA沉積，多核中性粒細胞在血管周圍浸潤，血清IgA和促炎細胞因子水平增多，因此該病被認為是一種特定的免疫介導的疾病[5]。該病復發率高，病程遷延，并發癥多，臨床多采用支持治療，對最嚴重的過敏性紫癜性腎炎(henoch-Schonlein purpura nephritis，HSPN)目前仍無滿意治療效果[6]。本文通過對構建的過敏性紫癜大鼠和兔模型及患者血液免疫學指標的檢測，比較指標的改變情況及異同，從而更好的依靠模型為人類疾病機制探討、診斷及治療提供幫助。

1 方法和材料

1.1 實驗動物和臨床標本

1.1.1 SD大鼠和新西蘭大耳白兔

4周齡SD大鼠，體重75～95 g，22只，模型組和對照組，每組雌雄各半，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司(SCXK(京)2012-0001)；1.5月齡日本大耳白兔28只，體重1.2～1.4 kg，18只雌雄各半為模型組，10只雌雄各半為對照組，北京芳元緣養殖場提供(SCXK(京)2009-0014)。動物飼養于中國醫學科學院醫學實驗動物研究所SPF級動物房(SYXK(京)2011-0022)，實驗操作已經過實驗動物研究所實驗動物使用管理委員會批準(許可證號：ILAS-PL-2012-005)。

1.1.2 人的標本

患者系長春中醫藥大學附屬醫院兒科住院兒童，4～12歲，多為住院2～5 d時采集的血液標本。患者全血及血清12份，對照全血及血清10份，這些患者主要表現為皮膚明顯的對稱性紫癜，主要在雙下肢，有的可見蛋白尿、血尿。對照血清多采自本院即將康復出院且無并發癥表現的兒童。

1.2 模型的構建

干姜、蓽茇、胡椒水煎劑購自中醫藥大學北京東直門醫院，1∶1∶1的比例混合配成終濃度15 g/100 mL的水溶液，模型組兔口服給藥，每次1 mL，模型大鼠灌胃給藥，每次0.5 mL，1次/日， 對照組分別給以等量生理鹽水，其他條件相同。用藥3 周，模型組兔腹腔注射含卵白蛋白(F5503, Sigma)10 mg的生理鹽水0.5 mL與弗氏完全佐劑(F5881，Sigma)以1:1比例混合的乳化溶液1 mL，大鼠注射0.5 mL，1次/周，連續3 周。對照組分別腹腔注射等量的生理鹽水。之后，模型組兔耳緣靜脈注射10 mg/mL的卵白蛋白生理鹽水0.5 mL，模型大鼠尾靜脈注射0.25 mL，同時大鼠和兔的背部皮膚剪毛，皮內注射0.3%卵白蛋白生理鹽水1 mL，分5點注射，每點0.2 mL。對照組分別以同樣劑量和方法給以等量生理鹽水。之后觀察皮膚紅腫狀況，照相存檔。

1.3 過敏性紫癜大鼠和兔模型的癥狀特點

抗原激發后，24 h內觀察模型組大鼠和兔的背部皮膚水腫，瘀斑的大小、分布、癥狀出現的比例及隨時間改變情況。

1.4 血液學指標檢測

抗原激發后24 h內，取大鼠和兔血，測大鼠、兔和人血常規(Rayto RT-7600S,USA)；1 000 r/min離心，取上清，放射免疫法檢測大鼠細胞因子IL-2,TNF-α (XH-6020γ-免疫計數器，China)；ELISA測細胞因子IL-4(KB2731,酶標儀ST-360,China)，流式細胞術方法檢測白細胞表面標記分子CD4(11-0040-82,eBioscience,USA),CD8(11-0084-82,eBioscience,USA)；用流式細胞儀 (BECTON DICKINSON FACSCalibur, USA)；免疫比濁法(HITACHI.7080, Japan)檢測血清IgA,IgE,IgG,C3,C4的含量。

ELISA方法檢測兔細胞因子IL-2 (CSB-E08745Rb,Cusabio,USA),TNF-α (CSB-E06998Rb,Cusabio,China)及白細胞表面標記分子CD3 (RTC0247,NeoBiolab,USA),CD4 (CSB-E12791Rb,Cusabio, China)，CD8 (CSB-E12790Rb,Cusabio,China)等，免疫比濁法檢測兔血清IgA,IgE,IgG,C3,C4的含量。

ELISA方法檢測患者血清免疫細胞表面標記分子CD3(BH5632,China),CD4 (BH1061,China),CD8(KA0133,China)，細胞因子IL-2(HE0064,China)，TNF-α (BH1105,China), IL-4(HE0060,China)；免疫比濁法檢測免疫球蛋白IgA,IgE,IgG及補體C3,C4的含量。

1.5 統計學分析

2 實驗結果

2.1 癥狀表現

大鼠和兔子在抗原激發后，24 h內均出現不同程度的出血斑點，大鼠的出血斑點在6～8 h出現，16～18 h后逐漸增多，彌散分布，直徑1 mm大小，周圍無紅腫滲出，出血斑點出現的比例大約為40%(4/10)；兔子的出血斑點在6～8 h出現，并逐漸增大，周圍有紅腫，14～18 h呈多個片狀紫斑，形狀不規則，直徑多在1 cm左右，少數有滲出，出血斑塊出現的比例約為85%(24/28)(封3圖1)。兩種模型動物出血斑在24 h后逐漸結痂壞死，2周后逐漸緩解，3周明顯好轉。

2.2 模型病理改變

模型大鼠和兔組織切片HE染色，光鏡下發現模型組大鼠和兔均出現不同程度的皮下出血，真皮水腫，血管擴張充血、出血，炎細胞浸潤；腎小球囊腔蛋白滲出物，血管擴張充血出血等；還可見到關節腔淤血，結締組織壞死，炎細胞浸潤等；胃黏膜可見出血，上皮細胞壞死脫落；小腸絨毛血管擴張充血，上皮細胞脫落；肺肝淤血，灶性炎細胞浸潤；還有少量大鼠和兔腦膜血管擴張充血，炎細胞浸潤等等。(封3圖2)

2.3 血液學指標

2.3.1 Hsp大鼠模型、兔模型及患者血常規檢測結果

模型組大鼠急性期血常規白細胞(WBC)升高，淋巴細胞(LYM)減少，中性粒細胞(Gran)升高(P<0.05)，淋巴細胞百分比(LYMPH%)減少，粒細胞百分比(Gran%)升高(P<0.01)，血小板(PLT)無明顯改變(圖3A)；模型兔WBC, Gran, 嗜酸性粒細胞(EOS)升高(P<0.05)，LYMPH%減少(P<0.01)，Gran%和嗜酸性粒細胞百分比(EOS%)升高(P<0.05)，PLT無明顯改變(圖3B)；患者(n=10)35%WBC升高，10%LYMPH下降，20%Gran升高，20%LYM%下降，30%Gran%升高，PLT無明顯改變。

2.3.2 Hsp大鼠模型、兔模型及患者血清免疫球蛋白及補體檢測結果

模型組大鼠血清免疫球蛋白IgA升高(P<0.05)，IgG升高(P<0.01)，補體C3，C4減少(P<0.05)，IgE無明顯改變(圖3C)；模型組兔血清IgA升高，IgG降低(P<0.05)，C3，C4減少(P<0.01)，IgE無明顯改變(圖3D)；患者(n=10)血清IgA， IgE升高(P<0.01)，IgG升高(P<0.05)，C3，C4減少(P<0.05)(圖3E)

2.3.3 Hsp大鼠模型、兔模型及患者血免疫細胞及細胞因子檢測結果

模型組大鼠、兔及患者血均有CD4百分比下降，CD4/CD8比值下降，IL-4、TNF-α水平升高，差別均具有統計學意義；模型大鼠和兔CD8%升高(P<0.05)，患者體內CD8%無明顯差異；模型組兔和患者體內IL-2水平下降(P<0.05)，模型大鼠體內IL-2水平無差異。(表1,2,3)

3 討論

過敏性紫癜大鼠和兔模型在表型上基本都出現了出血斑點的癥狀，但大小和程度不同，大鼠的皮膚斑點呈現彌漫形分布，直徑2 mm左右，周圍未見紅腫。兔的皮膚出血斑點大，直徑大多在1 cm左右，還有融合斑點，周圍紅腫。兩種模型在皮膚癥狀出現的時間上大致相同，在激發后6～8 h后開始出現反應，14～18 h后基本出現明顯癥狀。大鼠出現癥狀的比例不如兔子的高。所有的過敏性紫癜患者形成非瘙癢性皮疹，開始是短暫的紅斑丘疹或蕁麻疹樣水皰，之后成熟呈片狀出血斑和紫癜[7]，直徑最大超過10 mm，并可形成明顯的瘀斑，顏色從紅色到紫色，最后到鐵銹色直至褪去大概需要幾天或幾周[8]。大鼠和兔子模型在病理上有相似的改變，均出現關節結締組織炎癥、胃腸道粘膜損傷，出血、腎小球囊腔滲出物，血管擴張淤血等病變。75%的患者有關節炎癥狀，包括熱、腫脹、質地軟，該癥狀是短暫的，不會產生畸形，15%～25%的患者可在紫癜出現前先出現關節癥狀[9-10]。60%～65%的患者可形成急性腹痛，約30%的患者出現嘔吐和胃腸道出血[11]。腎臟疾病是最嚴重的后遺癥，雖然該病的死亡者很少，但腎臟疾病是導致死亡的主要原因[12]。綜上，兩種模型癥狀及病理改變與人類疾病相似，可為人類疾病研究提供幫助。

注：A 大鼠血常規結果B兔血常規結果C大鼠血免疫球蛋白和補體結果 D兔血免疫球蛋白和補體結果 E患兒血免疫球蛋白和補體結果(注：*P<0.05,#P<0.01，同對照組相比)。

表1 大鼠免疫細胞及細胞因子檢測

表2 兔血清免疫細胞及細胞因子檢測

表3 患者免疫細胞及細胞因子檢測

大鼠和兔模型急性期血常規都有WBC,NEU數目不同程度的增多，LYM減少，患者血常規檢測，雖也有WBC，NEU細胞數目增多，LYM細胞數目減少，但這種改變是散在的，不確定性的，大鼠、兔模型和患者血中都不存在LTP數目的明顯改變。模型大鼠、兔和患兒血清急性期存在不同程度的CD3含量下降，CD4%減少，CD8%增加，CD4/CD8比值下降，血清細胞因子IL-4，TNF-α水平增加，但在大鼠血清IL-2水平改變沒有差異，兔子血清IL-2水平下降，患兒血清IL-2水平增加。Wiercinaski[13]等在對HSP 急性期患兒外周血 T 淋巴細胞亞群檢測中發現CD4+T數量降低， CD8+T數量增高，CD4/CD8比值降低。該研究與我們的研究結果一致。有報道，HSP患者血清IL-4水平升高，IL-2水平降低[14]，該結果與兔模型的研究結果一致。研究表明過敏性紫癜腎炎患者IL-2水平降低，HSP急性期IL-2受體數目和功能較正常者升高和增強，與疾病的活動性相關[15]。該結果與本文患者研究結果相似，說明IL-2水平的改變沒有統一的結果。Besbas等[16]報道HSP患者急性期血清促炎細胞因子TNF-α的水平明顯增加，該報道與本文大鼠、兔及人的研究結果一致。因此HSP發病機制與T細胞功能改變密切相關。大鼠、兔、患者血清急性期IgA水平均增加，C3,C4水平均下降，但大鼠急性期IgE水平沒有明顯改變，IgG水平增加，兔急性期IgE沒有明顯改變，IgG水平減少，患者急性期血IgE, IgG水平均增加。HSP被認為是一種IgA免疫復合物介導的疾病[17]，IgA復合物沉積在皮膚、小腸及腎小球等部位激發局部的炎癥應答。目前報道超過一半的HSP病人血清IgA水平增加[9,18-19]。該報道與本文大鼠和兔模型及患者的檢測結果一致。Levy等[20]報道18.7%的HSP患者血清C4水平下降，Smith等[21]也報道8%的HSP患者血清C4水平下降，Islek等[22]報道的HSP患者中8%血清C3下降。這些結果與本文的檢測結果血清C3,C4均有不同程度的下降相似。HSP患者，C3,C4在組織損傷部位活性增強，但它們的血清水平與疾病的嚴重性不相關[23]。患者血清IgG, IgE水平文獻報道不完全一致，有報道IgG減少，增加或無明顯改變，IgE水平增加或無明顯改變[24-26]。普遍認為血清免疫球蛋白的失衡，主要增加腎臟受累的機會。Kondo[27]對HSP 患者 IgA 升高機制的研究發現活動性HSP，IgA分泌細胞的均值達正常的2倍, 其敏感性為95.7%， 特異性為90.9%[27]。可見，IgA是參與HSP發病機制的主要免疫球蛋白，其診斷對疾病的診斷具有重要意義。

綜上，過敏性紫癜兩種動物模型，發病癥狀、病理及免疫相關指標改變與人類疾病發病均相似，但相對而言，兔模型操作方便，發病穩定，體型大容易觀察。兩種模型可為該病機制研究和藥物篩選評價提供更多的研究途徑，也可根據需要選擇相應模型。

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