髖關節置換術后異位骨化的蛋白質組研究

莊穎峰，張旭鳴，許 瑋，林世水，邱美光，林志毅

·論 著·

髖關節置換術后異位骨化的蛋白質組研究

莊穎峰，張旭鳴，許 瑋，林世水，邱美光，林志毅

目的 使用蛋白質組方法，通過比較髖關節置換術后并發異位骨化與未并發異位骨化患者血清蛋白，尋找差異表達蛋白，篩選蛋白質標志物。方法 收集2009年8月～2012年3月14例髖關節置換術后患者血清，以髖關節置換術后并發異位骨化(heterotopic ossification,HO)記為HO組，以未并發異位骨化為正常組，蛋白質芯片聯合表面增強激光解析離子化飛行時間質譜 ( SELDI-TOF-MS) 技術檢測分析兩組蛋白質表達譜，尋找差異蛋白。對每個質荷比峰值進行Wilconxon秩和檢驗，篩選P<0.05的差異蛋白質峰。結果 檢測到154個高質量質譜蛋白質峰，其中質荷比為2748的蛋白點的峰值較正常組明顯下調，匹配蛋白質為α-2-HS糖蛋白B鏈(Alpha-2-HS-glycoprotein chain B，AHSG B-鏈)。結論 AHSG B-鏈的低表達與髖關節置換術后并發HO密切相關，可能為HO的敏感蛋白質標志物。

髖關節置換； 異位骨化； 蛋白質組； 胎球蛋白

我國國內自20世紀80年代開展髖關節置換術(hip arthroplasty,HA)以來，隨著關節外科技術的日漸成熟，HA在臨床上也得到越來越廣泛的應用，其并發癥也越來越受重視。異位骨化(heterotopic ossification，HO)導致關節疼痛及活動受限，已經成為HA術后的常見并發癥[1-2]； 嚴重的異位骨化導致患髖強直，關節功能喪失，髖關節置換手術失敗，對患者的生活質量造成了負面影響。Stoltny等[3]認為90%的全髖關節置換患者都存在發生HO的高危因素。全髖關節置換患者術后HO的發病率在5%～90%[4]。由于HO的病因與病理機制尚未完全了解，臨床上需要尋找更為敏感的蛋白質標記物以做出早期診斷。本研究應用蛋白質組學方法分析HA術后并發HO的患者與正常HA術后患者，尋找兩者之間的差異表達蛋白。希望所發現的差異表達蛋白能為HO的發生做出早期診斷，解析其發病機制，進而發現HO的特異蛋白質標記物。

材料與方法

1 標本

收集2009年8月～2012年3月14例髖關節置換術后患者血清，其中并發異位骨化7例，記為HO組； 未并發異位骨化7例，記為正常組。HO組病例入選標準： (1) HA術后早期出現的髖周持續性疼痛、輕度腫脹； 不同于傷口痛，無髓內感染征象; 病程進展，關節運動逐漸減小。(2) X線隨訪發現HO病灶,其Brooker分型[5]均為Ⅰ型; (3) 無嚴重肝、腎、造血系統、內分泌系統疾病和精神病者。14例HA患者手術切口均取后外側入路。HO組及正常組中全髖關節置換各4例； 人工股骨頭置換各3例。性別及年齡構成： HO組男性6例，女性1例; 平均年齡66.7歲； 正常組男性6例，女性1例； 平均年齡63.3歲。兩組間性別、年齡相當。

采集研究對象的外周靜脈血5ml，共14份。在無抗凝劑的10ml普通采血試管中室溫靜置1～2h，使血液凝固析出血清，2 000rpm離心5min，取其上清液加入Eppendorf管，-80℃低溫冰箱保存。

2 方法

2.1 主要儀器設備與試劑 蛋白核酸測定儀(Biophotometer 6131，德國Eppendorf公司)； PBS-Ⅱ-PLUS型SELDI-TOF-MS系統(美國Ciphergen Biosystem 公司)； 96孔蛋白質芯片工作平臺(Bio-processor，美國Ciphergen Biosystem 公司)； 全自動酶標讀數儀(ELX808，美國Bio Tek公司)； 50%乙腈； 50mol/L乙酸鈉； 9mol/L尿素(美國Sigma公司)； 2%3-環乙胺-1-丙磺酸(3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonic acid,CHAPS，美國Sigma公司)、1%二硫代蘇糖醇(trifluoro-acetic acid，TFA，美國Sigma公司)、0.5%三氟乙酸(美國Sigma公司)。

2.2 血清與芯片的預處理 冰浴上30～60min內緩慢溶解實驗組及對照組血清，4℃下10 000rpm離心4min。每5μl血清加入10μl U9血清變性溶液(9mol/L尿素，2%CHAPS，1% DTT配制而成)，4℃下600rpm搖床上振蕩30min使充分混合。以CM10芯片結合緩沖液(乙酸鈉2.051g溶于去離子水中，HCL調節pH值至4.0，定容為500ml，由此配制成50mmol/L乙酸鈉)將U9處理后的血清稀釋至200μl，搖床上振蕩使充分混合(600rpm，4℃，2min)。血清被稀釋約40倍。每孔CM10芯片中加入200μl結合緩沖液，室溫下搖床600rpm震蕩5min，使充分平衡后去除液體，重復平衡1次。

2.3 蛋白質與芯片結合及結合后的處理 取上述經U9處理并稀釋過的血清100μl加到芯片上，仔細檢查并去除每個孔中的氣泡以免其影響蛋白質與芯片的結合。芯片與血清充分反應1h(600rpm搖床上振蕩，4℃)后去除樣品。每孔加入200μl相應的結合緩沖液，搖床上振蕩5min(600rpm，室溫)后除去液體。重復該過程2次。用水(純度HPLC級)200μl快速清洗每個孔1次，用力甩干并將生物處理器倒扣在清潔的吸水紙上輕拍以去除多余的水。將芯片從生物處理器中取出，自然干燥。每孔點加50%飽和的SPA溶液(SPA的溶劑為50% H2O+50%乙腈+0.5% TFA。將SPA溶解于其溶劑中直至過飽和，13 000rpm離心1min后取上清液，與溶劑1∶1混合即可)1μl，待其自然干燥后重復點加1次。自然干燥即可上機檢測。

2.4 SELDI質譜儀參數設置及原始數據采集和輸出 首先用已知分子量的標準蛋白質芯片將SELDI質譜系統的分子量誤差校正到<0.1%，再將結合好蛋白質的芯片放入質譜儀中進行檢測。原始數據由Proteinchip Software 3.2軟件采集，設置激光強度為180，檢測靈敏度6，檢測上限100 000m/z，優化收集數據范圍2 000～20 000m/z，信號收集位置從20～80，每個樣本取168個點所收集信號的平均值。用Proteinchip Software 3.2軟件將原始數據以xlm的格式輸出。

3 數據處理與匹配蛋白質的查找

實驗數據采用由本研究建立的ZJU-PDAS(ZheJiang University-ProteinChip Data Analyze System)軟件分析。原始質譜圖上傳到服務器,先用小波變換(Undecimated Discrete WavISRt Transform，UDWT)去除質譜儀器本身造成的噪音,修正去除噪音后的質譜圖的基線。校正整個圖譜的分子量值，用局部極值法找出蛋白值峰，并過濾掉信噪比<4的峰。這時從每個樣本中找出來的峰的個數及其本身的質荷比值都不相同。將各個樣本中質荷比的差異<0.3%的峰聚為一類。將聚類后只出現在<10%的樣本中的峰去掉。再對找出的峰在各個樣本中的強度做均一化處理。對預處理完篩選出來的蛋白質峰做進一步的檢驗分析，Wilconxon秩和檢驗篩選P值<0.05的差異蛋白質峰。 根據差異蛋白質峰所對應的質荷比，結合芯片提供的等電點范圍，檢索Swiss-Prot數據庫，尋找匹配的蛋白質信息； 從而獲得蛋白質名稱、基因名稱、蛋白質功能、亞細胞定位及組織特異性等信息。

結 果

共檢測到154個經過信噪比和強調過濾的高質量質譜蛋白質峰。其中質荷比為2748的蛋白點的峰值較正常組明顯下調(表1和圖1)，與正常組之間差異有顯著意義(P<0.05)。

表1 HO組與正常組差異蛋白質峰

圖1 HO組與正常組CM10芯片蛋白質組表達譜比較(質荷比為2748的蛋白點)。檢索Swiss-Prot數據庫，質荷比為2748、等電點范圍為4～14的蛋白點的匹配蛋白質為： AHSG B-鏈

討 論

1 AHSG B-鏈的結構與功能

AHSG B-鏈是三糖(半乳糖、N-乙酰基半乳糖胺、O-糖苷)所組成的唾液酸，其多肽鏈部分由27個氨基酸殘基組成，含有2個β-折疊[6]。AHSG B-鏈通過1個二硫鍵與AHSG A鏈結合而形成胎球蛋白(AHSG)。AHSG B-鏈由肝臟合成并分泌入血，并有選擇地集中于骨基質； 牙本質中含量高于血漿蛋白。功能上具有鋇離子與鈣離子親和力，具有調理作用，可促進細胞內吞，影響骨礦物相。

2 AHSG在正常骨礦化中的作用

Saunders等[7]的一項動物實驗發現，綿羊胎兒的骨與軟骨組織如骨表面、骨髓中的AHSG呈高表達，表明AHSG可能在胎兒的骨與軟骨的發育中起重要作用。研究發現，胎兒的血清AHSG水平遠高于出生后，胎齡90d的牛胎兒AHSG水平約為20mg/ml，而成年母牛的AHSG水平約為1mg/ml[8]，AHSG水平的明顯變化提示其在胎兒的生長發育中起重要作用。美國的一項研究發現，健康社區老年婦女(年齡70～79歲)血清AHSG水平與髖關節或腰椎骨密度密切相關，AHSG水平每提高平均0.38mg/ml，其髖關節的骨密度測定值就增高0.016g/cm2[9]。Hamlin和Price[10]將脫鈣的骨骼置于血清中，觀察到重新礦化現象； 但置于含生理濃度的鈣、磷溶液中就無法被重新礦化。Toroian和Price[11]更進一步觀察到血清中去除AHSG后將無法使去礦化的骨骼重新礦化； 但加入AHSG后骨骼礦化發生了。這些實驗有力地闡明了AHSG在骨礦化中的作用，但其機制尚未完全明確。Price等[12]提出了“抑制劑排除”的假說來解釋AHSG的體外促礦化作用： 作為強效的鈣、磷礦化抑制劑，AHSG在Ⅰ型膠原纖維的外部抑制了羥基磷灰石晶體的形成； 但AHSG不能進入Ⅰ型膠原纖維內部，因而不能與骨礦化基本位點相結合，故Ⅰ型膠原纖維的礦化過程不受抑制。德國最近研究表明AHSG生理作用還表現為防止骺端軟骨基質過度礦化，該研究發現AHSG基因敲除小鼠(AHSG-/-)的肢體長骨發育嚴重障礙、骺板早閉，但其長骨生長面骨密度明顯增加[13]。另外，AHSG在人體內的作用由于涉及細胞等機體內、外環境而更為復雜，其生理功能的發揮可能與血管內皮細胞、成骨細胞等有關。

3 AHSG在異常骨礦化中的作用

人體的正常的礦化過程僅發生于骨骼及牙齒。病理性鈣化過程發生于全身所有的軟組織，最常見于脈管組織； 發生于軟組織內的成熟板狀骨即為HO。組織的礦化過程為下列3個因素的相互作用： 鈣磷濃度、適合礦化的環境以及鈣化抑制因子的水平[14]，任何一種因素的失調將可能導致異位骨化、血管鈣化的發生。機體內的礦物沉積必須有序進行并精確調節。AHSG可與血液循環中的堿性磷酸鈣等礦物鹽結合形成水溶性的鈣-蛋白顆粒(calciprotein particles,CPPs)，以防止礦物在人體內互相聚集而過度礦化，從而執行其抑制礦化作用。CPPs的礦化過程經歷了2個階段： 初級CPPs為直徑約50nm的球形顆粒，由AHSG單體(鈣、磷等礦物離子聚集成簇，形成礦化前體，再與AHSG聚合成AHSG單體)聚集而成； 室溫下，初級CPPs經歷數小時的結構重排形成次級CPPs，直徑擴大了約2倍，顆粒形態轉變為狹長狀； 顆粒核心的AHSG單體聚集更為緊密以確保次級CPPs能持續數天而保持狀態穩定，充足的時間有利其生理功能的發揮[15]。過量的含鈣、磷等礦化物質的CPPs必須被清除，以防止礦化物質在軟組織中的異常沉積。Herrmann等[16]的另一項研究提供令人信服的證據表明，小鼠肝臟枯否細胞及脾臟邊緣的巨嗜細胞能夠通過A類清道夫受體(scavenger receptor-A，SR-A)激活網狀內皮細胞系統迅速地清除CPPs。最近的一項研究首次發現，CPPs能夠誘導網狀內皮細胞系統表達與分泌TNF-α及IL-1β，產生炎癥反應，啟動細胞凋亡級聯反應導致細胞凋亡，導致病理性鈣化[17]。

總之，AHSG水平較低或CPPs水平較高都可能導致病理性鈣化[14]。我們的蛋白質組研究首次發現AHSG B-鏈的低表達與HA置換術后并發HO密切相關，可成為HO的敏感蛋白質標志物。由于AHSG B-鏈的低表達，導致礦物鹽在髖關節周圍的軟組織周圍異常礦化而出現HO。由于本研究樣本量較少，可能存在一定的誤差，今后的研究需進一步加大樣本量。同時我們認為，HO患者血清中AHSG B-鏈的低表達與AHSG低表達具有正相關性，但仍需后續的研究進一步明確。

[1] Brunnekreef JJ,Hoogervorst P,Ploegmakers MJ,et al.Is etoricoxib effective in preventing heterotopic ossification after primary total hip arthroplasty[J].Int Orthop,2013,37(4):583-587.

[2] Schauwecker J,Pohlig F,Toepfer A,et al.Heterotopic ossifications in total hip arthroplasty: prophylaxis and therapy[J].Orthopade,2011,40(6):500-505.

[3] Stoltny T,Koczy B,Wawrzynek W,et al.Heterotopic ossification in patients after total hip replacement[J].Orthop Traumatol Rehabil,2007,9(3):264-272.

[4] Board TN,Karva A,Board RE,et al.The prophylaxis and treatment of heterotopic ossification following lower limb arthroplasty[J].J Bone Joint Surg (Br),2007,89(4):434-440.

[5] Brooker AF,Bowerman JM,Robinson RA,et al.Ectopic ossification following total hip replacement. Incidence and a method of classification[J].J Bone Joint Surg(Am),1973,55(8):1629-1632.

[6] Gejyo F,Chang JL,Bürgi W,et al.Characterization of the B-chain of human plasma alpha 2HS-glycoprotein.The complete amino acid sequence and primary structure of its heteroglycan[J].J Biol Chem,1983,258(8):4966-4971.

[7] Saunders NR,Sheardown SA,Deal A,et al.Expression and distribution of fetuin in the developing sheep fetus[J].Histochemistry,1994,102(6):457-475.

[8] Brown WM,Saunders NR,M?llg?rd K,et al.Fetuin-an old friend revisited[J].Bioessays,1992,14(11):749-755.

[9] Ix JH,Wassel CL,Bauer DC,et al.Fetuin-A and BMD in older persons: the Health Aging and Body Composition(Health ABC) study[J].J Bone Miner Res,2009,24(3):514-521.

[10] Hamlin NJ,Price PA.Mineralization of decalcified bone occurs under cell culture conditions and requires bovine serum but not cells[J].Calcif Tissue Int,2004,75(3):231-242.

[11] Toroian D,Price PA.The essential role of fetuin in the serum-induced calcification of collagen[J].Calcif Tissue Int,2008,82(2):116-126.

[12] Price PA,Toroian D,Lim JE.Mineralization by inhibitor exclusion: the calcification of collagen with fetuin[J].J Biol Chem,2009,284(25):17092-17101.

[13] Seto J,Busse B,Gupta HS,et al.Accelerated growth plate mineralization and foreshortened proximal limb bones in fetuin-A knockout mice[J].PLoS One,2012,7(10):e47338.

[14] Herrmann M,Kinkeldey A,Jahnen-Dechent W.Fetuin-A function in systemic mineral metabolism[J].Trends Cardiovasc Med,2012,22(8):197-201.

[15] Heiss A,Pipich V,Jahnen-Dechent W,et al.Fetuin-A is a mineral carrier protein: small angle neutron scattering provides new insight on Fetuin-A controlled calcification inhibition[J].Biophys J,2010,99(12):3986-3995.

[16] Herrmann M,Sch?fer C,Heiss A,et al.Clearance of fetuin-A-containing calciprotein particles is mediated by scavenger receptor-A[J].Circ Res,2012,111(5):575-584.

[17] Smith ER,Hanssen E,McMahon LP,et al.Fetuin-A-containing calciprotein particles reduce mineral stress in the macrophage[J].PLoS One,2013,8(4):e60904.

(本文編輯： 賀 羽)

Proteomics study on heterotopic ossification after hip arthroplasty

ZHUANGYing-feng1,ZHANGXu-ming1,XUWei1,LINShi-shui1,QIUMei-guang1,LINZhi-yi2

(1.Department of Emergency Surgery，Provincial Clinical College of Fujian Medical University，Fujian Provincial Hospital，Fuzhou 350001，China； 2.Department of Nuclear Medicine，Fujian Provincial Hospital，Fuzhou 350001，China)

Objective The paper aims to seek the differentially expressed proteins and sensitive biomarker in the serum of the patients with heterotopic ossification (HO) after hip arthroplasty through comparing with the normal control group which did not occur heterotopic ossification by proteomic analysis. Methods The samples were divided into two groups: HO group and control group. The change of expressions of all proteins was assayed and analyzed by protein array and surface-enhanced laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (SELDI-TOF-MS) proteomics technology to seek the differentially expressed proteins. The ratios of mass/charge (m/z) of each peak were tested by Wilconxon rank sum test to seek the protein peak withP<0.05. Results Totally 154 high-quality mass spectrometry protein peaks were detected. The expressions were down-regulated in the protein spot with m/z of 2748 and the matching protein was Alpha-2-HS-glycoprotein chain B (AHSG B-chain). Conclusion The low AHSG B-chain level is closely relative to HO after hip arthroplasty and may be the sensitive biomarker of HO.

hip arthroplasty; heterotopic ossification; proteomics; fetuin

1009-4237(2014)02-0147-04

福建省衛生廳青年科研項目基金資助(2010-2-11)

350001 福建 福州，福建醫科大學省立臨床醫學院、 福建省立醫院急救中心外科(莊穎峰，張旭鳴，許瑋，林世水，邱美光)，核醫學科(林志毅)

R 687.4

A

2013-05-16；

2013-09-09)