異甘草素對創傷性腦損傷大鼠損傷灶修復作用的實驗研究

楊永明，荔志云

·論 著·

異甘草素對創傷性腦損傷大鼠損傷灶修復作用的實驗研究

楊永明，荔志云

目的 觀察異甘草素對創傷性腦損傷大鼠病理變化和血清白介素-1α(IL-1α)、IL-1β、IL-6、IL-10和腫瘤壞死因子-α(TNFα)的影響，探討其在創傷性腦損傷(TBI)后促進腦損傷灶康復的作用機制。方法 運用改良Feeney法建立大鼠腦損傷模型，將動物隨機分為假手術組、腦損傷組、異甘草素治療組，共治療5d，經平衡木行走試驗觀察神經行為學變化后處死，采用蛋白芯片法檢測血清中的細胞因子，HE染色光鏡下觀察損傷灶的變化。結果 與腦外傷組相比異甘草素治療組 IL-1α、IL-6、IL-10的血清含量明顯增高，IL-1β和TNFα的含量顯著降低(P<0.05)，損傷灶病理學變化明顯改善。結論 異甘草素可以促進創傷性腦損傷大鼠腦損傷灶康復，其機制可能與調節細胞因子有關。

腦損傷； 異甘草素； 大鼠

創傷性腦損傷(TBI)后的繼發性腦損傷可以導致神經組織的進一步損害,延長和(或)引起神經功能缺失[1-2]。目前缺乏有效防止繼發性腦損害的藥物，異甘草素具有廣泛的藥理活性[3]，具有減低腦損傷后氧化應激反應，增加腦供血量，改善腦組織能量代謝，抑制炎癥反應，抑制細胞凋亡等作用。本實驗通過異甘草素對腦損傷大鼠進行干預，用蛋白芯片檢測血液的細胞因子IL-1α、IL-11β、IL-6、IL-10和TNFα的含量，病理學觀察損傷灶的變化,探討異甘草素對創傷性腦損傷的影響，為腦損傷的治療提供實驗依據。

材料與方法

1 實驗動物及材料

清潔級Wistar雄性大鼠45只，由蘭州軍區蘭州總醫院動物實驗科提供，鼠齡2～3個月，體重150～200g； 蛋白芯片由Ray biotechnology公司提供，異甘草素(純度98%)由上海源葉生物科技公司提供，自制打擊器。

2 TBI模型制作

采用改良Feeney法[4]，自制打擊器，打擊棒重20g，下落高度30cm，打擊直徑3mm，打擊深度為3mm。大鼠用10%水合氯醛(30mg/kg，腹腔注射)麻醉后，固定頭部，消毒后于矢狀正中線切開頭皮,分離軟組織及骨膜, 用小型電鉆在左頂葉上方開直徑約4mm的骨窗,并保持硬膜完整。打擊棒沿金屬套管從30cm高度打擊大鼠頭部致傷(沖擊力為600g.cm)造成左側大腦半球局部腦挫裂傷。充分止血后，予以碘伏消毒傷口并縫合頭皮，假手術組僅開骨窗不打擊。

3 動物分組及給藥

隨機分為A組(假手術組)、B組(腦損傷組)、C組(異甘草素治療組)每組15只。用1%的吐溫80生理鹽水將異甘草素配置成懸液,濃度6mg/ml，術后2h C組給予異甘草素30mg/kg腹腔注射治療1次/d; A組和B組等體積的1%吐溫80生理腹腔注射1次/d，共治療5d。

4 平衡木行走試驗(beam-walkingtest)

各組任取10只大鼠做平衡木行走試驗，測定運動整合及協調能力，按Feeney的記分標準評分，評分越高大鼠運動整合及協調能力越差，評分完畢后將所有大鼠放回原組。

Feeney評分標準： 0分： 穿過平衡木，不會跌倒； 1分： 穿過平衡木，跌倒機會<50%； 2分： 穿過平衡木，跌倒機會>50%； 3分： 能穿過平衡木，但受累的癱瘓側后肢不能幫助向前移動； 4分： 不能穿過平衡木，但可坐在上面； 5分： 將大鼠放在平衡木上會掉下來。

5 細胞因子和腦含水量檢測

各組任取10只斷頭取血分離血清用蛋白芯片法檢測血清IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10和TNFα的含量。取大鼠損傷側腦組織，去除凝血，用冰冷生理鹽水沖洗腦組織表面血跡，濾紙吸去腦組織表面殘余水分，用電子天平測其濕重，然后于75℃通風烘烤箱烘烤72h至恒重，取出稱干重，計算含水量： 腦水含量=(濕重-干重)/濕重×100%。

6 病理學觀察

各組取5只大鼠用甲醛做腦內固定后取大腦,甲醛外固定,常規石蠟包埋,腦組織切片(片厚3μm),HE染色,Olympus顯微鏡放大400倍，觀察病理學改變。

結 果

1 細胞因子檢測結果

與腦損傷組比較，異甘草素治療組 IL-1α、IL-6、IL-10的血清含量明顯增高，IL-1β和TNFα的含量顯著降低，見表1。

表1 異甘草素對腦損傷大鼠血清細胞因子的影響±s，n=10,pg/ml)

B組與A組比較:P<0.05; C組與B組比較:P<0.05

2 平衡木行走試驗Feeney評分結果

A組0.33±0.12，B組4.12±0.87,C組2.12±0.57。與B組(腦損傷組)比較，C組(異甘草素治療組)Feeney評分明顯減低(P<0.01)。

3 腦含水量檢測結果

A組(71.1±1.92)%,B組(75.53±2.13)%,C組(73.20±1.54)%。與B組(腦損傷組)比較，C組(異甘草素治療組)腦含水量減少(P<0.05)。

4 病理改變

4.1 大體觀察 A組大腦外觀良好，腦皮層結構完整，僅在左頂葉見開骨窗時的壓痕； B組見左頂葉組織結構破壞，形成一較大創面； C組左頂葉見創面已經愈合遺留外傷后瘢痕灶(圖1～3)。

4.2 損傷處皮層組織切片觀察 A組腦皮層組織結構良好，細胞大小形態較一致，神經元細胞結構良好； B組腦皮層組織結構破壞，神經元細胞消失，可見大量紅細胞，少量膠質細胞； C組腦皮層組織結構破壞，神經元細胞消失，可見紅細胞大部分被清除殘留少許紅細胞，大量膠質細胞(圖4～6)。

圖1 A組 圖2 B組 圖3 C組

圖4 A組(HE×400) 圖5 B組(HE×400) 圖6 C組(HE×400)

討 論

創傷性腦損傷后，原發性和繼發性腦損傷引起血腦屏障破壞，外周血細胞和腦組織內免疫細胞(神經元細胞和膠質細胞)釋放大量細胞因子[5],白細胞介素等細胞因子是參與腦繼發性炎癥反應的重要信號轉導分子[6]，既可以加重腦損傷又可以減輕腦損傷。IL-1α在神經系統有重要作用，適度的IL-1α可以提高神經干細胞向多巴胺能神經元分化[7]，過度的表達可引起神經退行性疾病[8]，IL-1β過量表達可能通過多種途徑在顱腦損傷中發揮作用,介導神經元壞死、缺失,引起繼發性腦損害[9]。IL-6的水平和疾病的嚴重程度及預后有關[10-11],IL-6在重癥腦損傷中是具有保護作用的細胞因子[12]。IL-10具有很強的抗炎作用,它可以抑制某些炎癥因子,如IL-2、IL-1B、TNF-A等的合成及活性,有助于控制炎癥,保持內環境的穩定[13]。TNFα可以直接作用于腦損傷區及其周圍的血管內皮細胞,破壞它們之間的緊密聯接[14]。異甘草素是一種黃酮類化合物，在中樞神經系統有廣泛的藥理作用，Zhan和Yang[15]研究發現異甘草素對小鼠的局灶性缺血可以提高Na+-K+-ATP酶活性保護腦組織，但目前國內外異甘草素治療創傷性腦損傷的研究報道很少，在本實驗中可以發現異甘草素可以提高IL-1α、IL-6、IL-10含量，減低TNFα和IL-1β的含量，異甘草素還可以促進膠質細胞增殖，增強吞噬細胞對病灶中紅細胞的清除能力，降低腦組織水腫，改善大鼠的運動整合及協調能力，促進腦組織傷口愈合。甘草素調節細胞因子的作用與神經行為學和病理學改善同時出現，推測其對創傷性腦損傷大鼠損傷灶修復作用的機制可能與調節細胞因子降低組織炎癥反應有關。

[1] Doberstein CE,Hovda DA,Becker DP,et al.Clinical considerations in the reduction of secondary brain injury[J].Ann Emerg Med,1993,22(6):993-997.

[2] Nida TY,Biros MH,Pheley AM,et al.Effect of hypoxiaor hyperbaric oxygen on cerebral edema following moderate fluid percussion or cortical impact injury in rat[J].Neurotrauma,1995,12(1):77-85.

[3] Haraguchi H,Ishikawa H,Mizutani K,et al.Antioxidative and superoxide scavenging activities of retrochalcones in Glycyrrhiza inflata[J].Bioorg Med Chem,1998,6(3):339-347.

[4] Feeney DM,Boyeson MG,Linn RT,et al.Responses to cortical injury: I. Methodology and local effects of contusions in the rat[J].Brain Res,1981,211(1):67-77.

[5] Lenzlinger PM,Morganti-Kossmann MC,Laurer HL，et al.The duality of the inflammatory response to traumatic brain injury[J].Mol Neurobiol，2001,24(1-3):169-181.

[6] Lentsch AB,Ward PA.Activation and regulation of NF-kappa B during acute inflammation[J].Clin Chem Lab Med,1999,37(3):205-208.

[7] Ling ZD,Potter ED,Lipton JW,et al.Differentation of mesencephalic progenitor cells into dopaminergic neurons by cytokines[J].Exp Neurol,1998,149(2):411-423.

[8] Griffin WS,Mrak RE.Interleukin-1 in the genesis and progression of and risk for development of neuronal degeneration in Alzheimer's disease[J].J Leukoc Biol,2002,72(2):233-238.

[9] Marini H,Altavilla D,Bellomo M,et al.Modulation of IL-1 beta gene expression by lipid peroxidation inhibition after kainic acid-induced rat brain injury[J].Exp Neurol,2004,188(1):178-180.

[10] Woiciechowsky C,Schoning B,Cobanov J,et al.Early IL-6 plasma concentrations correlate with severity of brain injury and pneumonia in brain injured patients[J].J Trauma,2002,52(2):339-345.

[11] Singhal A,Baker AJ,Hare GM,et al.Association between cerebrospinal fluid interleukin-6 concentrations and outcome after severe human traumatic brain injury[J].J Neurotrauma,2002,19(8):929-937.

[12] Winter CD,Pringle AK,Clough GF,et al.Raised parenchymal interleukin-6 levels correlate with improved outcome after traumatic brain injury[J].Brain,2004,127(Pt2):315-320.

[13] Knoblach SM,Faden AI.Interleukin-10 improves outcome and alters proinflammatory cytokine expression after experimental traumatic brain injury[J].Exp Neurol,1998,153(1):143-145.

[14] Zhang X,Li H,Hu S,et al.Brain edema after intracerebral hemorrhage in rats:the role of inflammation[J].Neurol India,2006,54(4):402-407.

[15] Zhan C,Yang J.Protective effects of isoliquiritigenin in transientmiddle cerebral artery occlusion- induced focal cerebral ischemia in rats[J].Pharmacol Res,2006,53(3):303-309.

(本文編輯： 賀 羽)

Repairing effects of isoliquiritigenin on traumatic brain injury in rats

YANGYong-ming,LIZhi-yun

(Department of Neurosurgery,Lanzhou General Hospital,Lanzhou Military Command,Lanzhou 730050,China)

Objective To observe the effect of isoliquiritigenin on pathological changes and serum IL-1α,IL-11β,IL-6,IL-10 and TNFα after traumatic brain injury in rats and to investigate its possible mechanism for brain rehabilitation. Methods Rats were randomly divided into 3 groups: sham-operated group,traumatic brain injury(TBI) group and isoliquiritigenin-treated group. TBI model was established with the modified Feeney’s method. After 5 days of treatment，the TBI rats were sacrificed to measure the serum cytokines by protein chip and to observe the pathology of the brain tissues under optical microscope through HE staining. Results Compared with the TBI group,IL-1β and TNFα were decreased,IL-1α,IL-6 and IL-10 were remarkably increased,the pathology of the brain tissues was notably alleviated. Conclusion Isoliquiritigenin can promote brain tissue rehabilitation of traumatic brain injury in rats. The underlying mechanism of this effect may be associated with the cytokines which can regulate brain tissue.

brain injury； isoliquiritigenin； rats

1009-4237(2014)02-0144-03

2012解放軍總后勤科研項目(CLZ12J006)

730050 甘肅，蘭州軍區蘭州總醫院神經外科

荔志云，E-mail: Lizhiyun456@163.com

R 651

A

2013-10-16；

2013-11-18)