缺血后處理對大鼠腦缺血/再灌注損傷內質網應激通路相關分子的影響

劉 楠， 于雪凡， 李 巖， 牛振華

腦缺血/再灌注(ischemia/reperfusion)損傷是急性腦梗死血栓再通后的一種常見的病理生理現象，可以引起一系列級聯反應，包括鈣離子穩態破壞、興奮性毒性氨基酸產生、氧化應激、線粒體功能障礙等，最終導致細胞壞死或凋亡。研究證明，內質網應激在腦缺血/再灌注損傷導致的神經細胞凋亡中發揮重要作用［1］。缺血后處理(ischemic postconditioning)是指在再灌注早期，重復給予幾次短暫的的非致死性的血管閉塞與再通的過程［2］，被認為是一種缺血/缺氧耐受現象。缺血后處理腦保護作用逐漸為人們所認識，但其機制尚不完全清楚。Hayashi等人的研究發現，腦缺血預處理可以激活適當的內質網應激，增強內質網處理未折疊蛋白反應(UPR)的能力，促進內質網功能的恢復，延緩和減輕缺血/再灌注造成的組織損傷［3］。缺血后處理是否也可以通過減弱內質網應激(ERS)從而發揮神經保護作用，目前國內外研究較少［4］。本研究從ERS角度探討缺血后處理在大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷中的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組和模型制備 動物分組:清潔級健康成年雄性Wistar大鼠58只，體重240～280 g，由吉林大學白求恩基礎醫學院實驗動物中心提供。將大鼠隨機分為假手術組(sham組 n=6)、缺血/再灌注組(I/R組n=26)和缺血后處理組(IP組n=26)。后兩組依據再灌注時間不同再分為6 h、12 h、24 h 3個亞組。

改良Longa［5］線栓法制備左側大腦中動脈阻塞(MCAO)模型:大鼠用10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉。仰臥位固定，頸部正中切口，延左側胸鎖乳突肌內緣分離肌肉和筋膜，分離頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)并掛線備用，結扎CCA和ECA，在頸外動脈剪一小口，將制備好的線栓插入ECA經CCA分叉處進入ICA，通過大腦中動脈起始端至大腦前動脈近端(插入深度平均約18.5±0.5 mm)，直至稍感阻力，扎緊備線，固定線栓。缺血2 h后拔出線栓實施再灌注6 h、12 h、24 h。假手術組僅暴露CCA、ECA及ICA，不做插線處理。缺血后處理組實施方法為缺血2h后將線栓拔至 CCA分叉處，實現再灌 10 min，后再次行MCAO 10 min，隨后分別實現再灌注 6 h、12 h、24 h。所有實驗動物均術前禁食12 h，不禁水，術中及術后維持肛溫在37℃，術后單籠飼養。

1.2 神經行為學評分 腦缺血2 h再灌注24 h，由不知分組情況的觀察者根據Zea Longa 6級5分制評分法［5］對大鼠進行評分。評分標準:0分:無神經損傷癥狀;1分:不能完全伸展對側前爪;2分:向對側轉圈;3分:向對側傾倒;4分:不能自發行走，意識喪失;5分:死亡。其中評分為1～3分且無蛛網膜下腔出血的大鼠納入分組，0分、4分和5分剔除，并隨機補充。

1.3 腦梗死體積測定 腦缺血2 h再灌注24 h后，將大鼠麻醉，迅速斷頭取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，于-20℃冰箱中速凍15 min，沿著冠狀切面切成6片，每片厚度約2 mm，將腦片放入2%TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)溶液中，37 ℃避光染色30 min，正常腦組織染成紅色，梗死灶成白色。將腦片置于4%多聚甲醛溶液固定4～6 h后，數碼相機拍照，應用Image J圖像分析軟件計算腦片梗死面積。根據公式V=(A1+～+An)t算出梗死體積，其中t為切片厚度，A為梗死面積。結果以梗死體積占缺血側總體積的百分比表示。梗死體積百分比(%)=梗死體積/缺血側總體積×100%［6］。

1.4 免疫組化標本取材與制備 大鼠經10%水合氯醛腹腔麻醉，打開胸腔，先后用生理鹽水和4%多聚甲醛行心臟灌流，斷頭取腦，置于4%多聚甲醛中固定24 h。于視交叉后1.7～4.0 mm冠狀切片，取中間切塊逐級脫水、透明、浸蠟，常規石蠟包埋制作石蠟標本，保存于4℃冰箱中備用。

1.5 免疫組化檢測GRP78、caspase-12蛋白表達 免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術公司(PV-6000)，嚴格按照說明書進行操作。一抗(Abcam公司)工作濃度1∶50。DAB顯色后蘇木素輕度復染。常規封片，鏡下進行定性觀察(圖1A箭頭所示為觀察部位)。判斷標準:鏡下胞質或胞核有棕黃色顆粒者為陽性細胞。在10×40倍光鏡下每張切片隨機選5個不重復視野進行拍照，應用Image pro plus圖像分析軟件計數各指標的陽性細胞數。陽性細胞率(%)=陽性細胞數/總細胞數×100%。

2 結果

2.1 大鼠神經行為學評分比較 假手術組無神經系統損害，評分為0;后處理組神經缺損程度明顯減輕，低于缺血/再灌注組，差異有統計學意義(t=4.304，P=0.000)(見圖1B)。

2.2 腦梗死體積百分比的比較 假手術組腦組織呈均勻紅色，無梗死灶;與缺血/再灌注組相比，后處理組梗死體積減小，差異有統計學意義(t=5.559，P=0.000)(見圖1C、圖 1D)。

2.3 免疫組化檢測GRP78、caspase-12蛋白表達 Sham組缺血半暗帶GRP78、caspase-12陽性細胞僅少量表達。與sham組相比，I/R組再灌注后6 h、12 h、24 h GRP78、caspase-12 陽性細胞數量明顯增加，GRP78于再灌注后12 h達高峰，caspase-12于再灌注后24 h達高峰，差異均有統計學意義(P＜0.05)。與 I/R 組相比，Ipost組再灌注 12 h、24 h GRP78陽性細胞數量明顯增加(見圖2)，再灌注后24 h caspase-12陽性細胞數量明顯減少(見圖3)，差異均有統計學意義(P＜0.05)(見表1、表2)。

表1 腦組織缺血半暗帶內GRP78蛋白陽性細胞率的比較(，n=6)

表1 腦組織缺血半暗帶內GRP78蛋白陽性細胞率的比較(，n=6)

與假手術組相比*P＜0.05;與缺血再灌注組相比#P＜0.05

組別 再灌注6 h 再灌注12 h 再灌注24 h假手術組腦缺血/再灌注組腦缺血后處理組40.17 ±5.04*47.83 ±7.52 55.33 ±8.71*66.17 ±7.31#6.50 ±2.74 45.00 ±9.84*61.17 ±13.11#

表2 腦組織缺血半暗帶內caspase-12蛋白陽性細胞率的比較(，n=6)

表2 腦組織缺血半暗帶內caspase-12蛋白陽性細胞率的比較(，n=6)

與假手術組相比*P＜0.05;與缺血再灌注組相比#P＜0.05

組別 再灌注6 h 再灌注12 h 再灌注24 h假手術組腦缺血/再灌注組腦缺血后處理組26.00 ±7.56*23.33 ±6.86 33.83 ±5.67*26.83 ±7.52 7.17 ±3.37 53.67 ±6.77*39.00 ±14.35#

圖1 大鼠腦缺血2 h再灌注24 h神經行為學評分與腦梗死體積

圖2 GRP78免疫組化染色

圖3 Caspase-12免疫組化染色

3 討論

腦缺血/再灌注損傷主要是指缺血腦組織恢復血液灌注后，腦組織損傷反而加重，導致缺血及周邊區域神經細胞壞死和凋亡。在局灶性腦缺血/再灌注損傷中，位于缺血中心區的神經細胞多發生壞死，無法再生，而缺血周邊區即半暗帶的損傷相對較輕，該區域的神經細胞多表現為凋亡。因此，挽救缺血半暗帶的神經細胞就成為腦梗死治療的重點。缺血后處理是指在再灌注早期進行短暫的、一次或多次亞致死性血管閉塞與再通［2，7］。腦缺血后處理可以減少梗死體積，抑制神經細胞凋亡，具有神經保護作用［8～10］。自缺血后處理的概念被提出后，關于其治療時間窗、再灌注/缺血循環次數、循環時程、潛在的保護機制等，仍無統一定論。本研究采用Pignataro等［8］的再灌注10 min/缺血10 min的后處理操作，結果顯示缺血后處理組腦梗死體積較缺血/再灌注組明顯減低，且神經功能缺損程度明顯改善，可見此后處理方法對大鼠腦缺血/再灌注損傷有保護作用。

內質網是真核細胞中重要的細胞器，它由封閉的膜系統及其圍成的腔形成互相溝通的網狀結構，對細胞正常功能的維持至關重要［11］。內質網在調節膜蛋白、分泌蛋白的折疊與加工、鈣的儲存與釋放方面具有重要的作用［12］。研究表明，腦缺血/再灌注可以引起內質網固有蛋白折疊或加工過程受阻、鈣離子穩態被打破，導致內質網功能障礙，從而觸發ERS［1］。目前認為，ERS介導的神經細胞凋亡在缺血性腦卒中病理生理學機制中發揮重要作用［12，13］。GRP78屬于熱休克蛋白70(HSP70)家族一員［14］，同時也是內質網重要的分子伴侶［15］。生理狀態下，GRP78分別與 PERK、IRE1α、ATF6(感受內質網應激信號的3種跨膜蛋白)暴露于ER腔中的結構域結合，處于非活化狀態。內質網功能障礙時，未折疊蛋白大量聚集，GRP78便與 PERK、IRE1α、ATF6解離，轉而與未折疊蛋白結合，由此促進蛋白質的正確折疊。ERS是細胞的一種自我保護機制，以恢復內質網內環境穩態，但是嚴重且持續時間較長的ERS將最終導致神經細胞凋亡。Caspase-12定位于ER外膜，是介導ERS凋亡的關鍵分子，在死亡受體或線粒體凋亡途徑中不被活化。Caspase-12缺陷鼠能抵抗ERS引起的凋亡而其他死亡刺激仍可誘導其發生凋亡，表明caspase-12與ERS介導凋亡的機制有關，而與非ERS介導的凋亡無關［16］。生理情況下，caspase-12以無活性的酶原形式存在，ERS狀態下，caspase-12酶原特異性激活，進而激活下游caspase-9、caspase-3 級聯反應，介導細胞凋亡［17］。

本研究結果顯示，腦缺血2 h再灌注6 h缺血半暗帶GRP78、caspase-12蛋白表達開始增加，GRP78于再灌注后12 h達高峰，caspase-12于再灌注后24 h達高峰，與 Shibata等［18］的報道一致。與缺血再灌注組相比，缺血后處理組再灌注后12 h、24 h GRP78蛋白表達明顯增加，再灌注后24 h caspase-12蛋白表達明顯減少。上述發現說明，腦缺血/再灌注損傷啟動了內質網應激反應，誘導了GRP78和caspase-12的表達。缺血后處理組上調了內質網應激蛋白GRP78的表達，減弱了caspase-12的表達。因此缺血后處理可以通過減弱內質網應激從而發揮神經保護作用，抑制神經細胞凋亡。

綜上所述，缺血后處理可明顯改善大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷所致的神經功能缺損癥狀，并減少腦梗死體積，具有神經保護作用。其機制可能與上調GRP78的表達、抑制caspase-12的表達相關。說明腦缺血后處理可能通過減弱內質網應激過程從而對隨后發生的再灌注損傷起到了神經保護作用。

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