miR-125a/TRAF6調控通路在破骨細胞分化中的 作用研究

楊麗，趙新蘭，雷丹丹，廖斌，秦愛平

論著·基礎

miR-125a/TRAF6調控通路在破骨細胞分化中的 作用研究

楊麗，趙新蘭，雷丹丹，廖斌，秦愛平

目的研究miR-125a在破骨細胞分化過程中的作用及其作用機制，方法單核細胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子-κB配體的受體激活劑(RANKL)誘導CD+14PBMCs向破骨細胞分化。生物信息學運算預測miR-125a的靶基因以及結合于miR-125a啟動子區域的轉錄因子。實時定量PCR法檢測miR-125a以及其他相關基因的表達。過表達實驗和抑制試驗用于研究miR-125a在破骨細胞分化中的作用及其與靶基因之間的相互關系。熒光素酶報告基因實驗驗證miR-125a與其靶基因之間的結合。結果(1)miR-125a表達在CD+14PBMCs前體細胞高表達，隨著誘導時間的延續逐漸下降，在誘導第5天開始明顯下降并在第15天達到最低值,表明miR-125a的表達在破骨細胞分化過程中呈現明顯下降趨勢。(2)miR-125a參與調控RANKL和M-CSF誘導的破骨細胞分化,過表達miR-125a明顯抑制了TRAP和NFATc1的mRNA表達和CD+14PBMCs向破骨細胞的分化。(3)miR-125a直接作用于靶基因腫瘤壞死因子相關因子6 (TRAF6)，TRAF6是RANKL/RANK/NFATc1信號轉導通路的轉錄因子，過表達miR-125a降低了TRAF6的蛋白表達水平，而TRAF6的mRNA水平無明顯改變。結論miR-125a通過作用于新的TRAF6/NFATC1/miR-125a負反饋調控環路在破骨細胞的分化中發揮了重要的調控作用，調控miR-125a的表達可能成為骨代謝疾病新的治療靶點。

microRNA; 破骨細胞分化; 轉錄因子；靶基因；負反饋調節

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.2 主要儀器： Nikon 300型自動攝像倒置顯微鏡(日本Nikon公司生產)，電泳儀、轉印儀、紫外交聯儀、凝膠成像系統(美國Bio．Rad公司生產)，流式細胞儀(美國Coulter公司)。

1.1.3 主要試劑： 無酚紅a-MEM培養液、Trizol、及胎牛血清(FBS)、0.25%胰酶-EDTA、膠原酶(美國Gibico公司生產)，RANKL(美國Invitrogen公司生產)，M-CSF(美國Sigma公司)，TRAP染色試劑盒(美國Sigma公司), 染色質免疫沉淀實驗試劑盒(Upstate, Charlottesville, VA), anti-miR-125a(GenePharma Co., Ltd), NFATc1 siRNA(OriGene Technologies Inc)。

1.2 方法

誘導液(25 ng/ml重組人類巨噬細胞集落刺激因子+30 ng/ml RANKL)誘導破骨細胞分化?？咕剖崴嵝粤姿崦?TRAP)染色法鑒定破骨細胞的成熟，同時檢測組織蛋白酶免疫染色并檢測破骨細胞分化標志性基因，如RAP和活化T細胞核因子磷酸酶依賴因子1的mRNA的表達水平。

1.2.2 實時定量PCR分析： 利用羅氏實時熒光定量PCR儀，方法按參考文獻[10]。 miR-125a、U6、TRAF6、NFATc1、TRAP和β-actin的引物見表1、表2， U6和β-actin作為內參。

表1 mRNA實時定量RT-PCR引物序列

表2 mRNA實時定量RT-PCR引物序列

注: F. 正向引物; R.反向引物; Acc. No. Genbank公布的準入號

1.2.3 TRAP染色： 利用TRAP染色試劑盒進行染色。在顯微光鏡下(× 200)隨機挑選10個視野觀察TRAP染色陽性的細胞(細胞核≥3)，每個視野計數重復3次，取平均值。

1.2.4 免疫組化: PBMCs的培養方法同前。多聚甲醛固定誘導液下培養于二孔板中的破骨細胞。破骨細胞免疫染色方法按參考文獻 [11]。

1.2.5 miR-125a靶基因預測： 目前有大量miRNA靶基因預測軟件，其各有特點。TargetScan軟件是一個常用的預測軟件。在本研究中利用TargetScan預測并使用RNA22-HSA進行驗證。

1.2.6 質粒構建與轉染： 質粒構建方法按參考文獻[12]，構建包含所預測miR-125a結合位點的WT-pGL3-TRAF6-3′UTR。引物如下，F：5′-GGCTCTAGACTAATAGGGAGATGATTT-3′，R：5′-GGCCGGCCGCATTACCAGACAACTTTA-3′。MUT-pGL3-TRAF6-3′UTR. 突變引物如下，F：5′-TATCGTGGAATCTAGTTCTCCG CGAGACCCGCAACTAGTATAAG-3′，R：5′-GCTTATACTAGTTGCGGGTCTCGCGGAGAACTAGATTCCA CGATA-3′miR-125a 特異性抑制劑2′-O-甲基反義寡核苷酸(anti-miR-125a)和脂質體復合體嚴格按說明書直接和細胞混合。

1.2.7 熒光素酶報告基因實驗： 外周血單核細胞與野生型或突變型 pGL3-TRAF6-3′UTR和miR-125a 或 miR-C共培養48 h?？罩|體作為陰性對照。

雙熒光素酶報告基因系統(Promega)和光度計用以熒光信號定量。每個熒光素酶值通過海腎熒光素酶值進行校正。

2 結 果

圖3 miR-125a抑制破骨細胞分化的標志性基因NFATC1的表達

2.3 miR-125a直接作用于靶基因腫瘤壞死因子相關因子6 (TRAF6) 利用TargetScan軟件預測miR-125a的靶基因。在TRAF6的3′UTR區存在miR-125a的堿基互補序列(圖4A)。TRAF6是破骨細胞分化中的重要調控因子。

我們檢測了調控破骨細胞分化的一些重要基因如c-Fos、Mitf和NF-κB基因在轉染pre-miR-125a或miR-C以及anti-miR-125a或anti-C前后的表達情況。結果示，miR-125對c-Fos和Mitf基因的表達沒有影響，過表達miR-125a促進NF-κB的蛋白表達，反之則抑制其表達(圖4E)。而NF-κB不是miR-125a的靶基因。

注：A.圖示標明了在TRAF6的3’UTR端存在有miR-125a的結合位點。并且標注了與miR-125a結合序列結合的野生型(WT)TRAF6- 3’UTR以及突變型(MUT)TRAF6- 3’UTR

B，C.miR-125a在轉錄后水平抑制TRAF6的表達。過表達或抑制miR-125a的表達可以降低或提高TRAF6的蛋白表達水平而不影響其mRNA表達水平。與對照組比較，aP<0.05

D.熒光素酶報告基因實驗示：共轉染pre-miR-125a可以降低野生型(WT)TRAF6- 3’UTR的熒光素酶活性而不影響突變型(MUT)TRAF6- 3’UTR的熒光素酶活性。與對照組比較，aP<0.05

E.過表達或下調miR-125a的表達可抑制或升高NF-κB蛋白水平卻對破骨細胞分化相關的其他一些關鍵基因無直接作用

圖4 miR-125a直接作用于其靶基因TRAF6

3 討 論

本研究發現過表達miR-125a抑制了TRAP+多核巨細胞的生成同時也抑制了TRAP 和NFATc1的基因表達。反之則結果相反。表明miR-125a在破骨細胞的分化過程中起到了重要的調控作用。

研究已發現miRNAs通過與靶基因的3’UTR結合來抑制靶基因的轉錄或降低靶基因mRNA的穩定性。我們利用TargetScan軟件預測發現RANKL信號轉導因子腫瘤壞死因子相關因子6 (TRAF6)是我們所預測的靶基因之一。結果提示miR-125a通過與TRAF6 mRNA的3’UTR結合來調控破骨細胞的分化。

TRAF6是NF-κB受體活化因子(RANK)的重要的銜接分子，在破骨細胞膜與RANK結合并激發了TRAF6的募集并進一步激活NF- κB和NFATc1促使破骨細胞的形成[15，16]。TRAF6是TRAF超家族和白介素-1/Toll樣受體超家族的重要信號轉導因子。研究報道TRAF6和RANK的耦聯對于破骨細胞的骨吸收功能的維持至關重要。因此，TRAF6在破骨細胞分化和成熟過程中其重要的調控作用[17]。

本研究證實miR-125a通過作用于靶基因TRAF6調控破骨細胞分化。熒光素酶報告基因實驗顯示過表達miR-125a可抑制野生型TRAF6熒光素酶報告基因活性，而突變型TRAF6熒光素酶報告基因載體可取消該作用。另外，過表達和抑制試驗表明miR-125a在轉錄后水平抑制TRAF6的表達水平。而對其他一些可能對破骨細胞分化起調控作用的基因例如：c-Fos、小眼畸形相關轉錄因子(Mitf)和NF-κB的表達沒有影響。這些結果提示miR-125a在轉錄后水平抑制TRAF6基因的表達。

本研究數據可以得出miR-125a的作用模式。破骨細胞分化信號在破骨細胞前體細胞激活TRAF6/NFATc1轉導通路，miR-125a表達的下降維持了TRAF6的蛋白表達并維持了破骨細胞分化過程。因此，一個新的miR-125a/TRAF6調控通路被挖掘出來。

綜上所述，本研究證實了miR-125a通過一個新發現的調控通路參與破骨細胞的分化調節。我們的研究為miRNA在破骨細胞分化中的作用提供了新的認識，揭示了miR-125a在破骨細胞分化過程中的重要作用并使miR-125a表達的調控,可能成為治療骨代謝疾病的新的手段。

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EffectofmiR-125a/TRAF6/NFATC1loopmediatesonosteoclastogenesis

YANGLi*,ZHAOXinlan,LEIDandan,LIAOBin,QINAiping.

*DepartmentofEndocrinology,HunanProvinceMawangduiGeriatricHospital,Changsha410016,China

QINAiping,E-mail:qinaip@163.com

ObjectiveTo investigate the effect of miR-125a in the process of osteoclast.MethodsMonocyte colony stimulating factor (M-CSF) and nuclear factor kappa B ligand / receptor activator (RANKL) induced CD+14PBMCs to osteoclast. The target gene bioinformatics arithmetic predictive miR-125a and miR-125a binding to initiate transcription factor sub region. To detect the expression of miR-125a using real-time quantitative PCR and other related genes. Overexpression experiments and inhibition test were used to investigate the relationship between effect of miR-125a in osteoclast differentiation and target gene. Used the luciferase reporter gene experiments to verify the combination between miR-125a and its target gene.Results(1) miR-125a expression in CD+14PBMCs precursor cells showed high expression level, with a continuation of the induction time, the expression decreased gradually, and reached the lowest value at fifteenth days, which showed that the expression of miR-125a revealed a clear downward trend in osteoclast differentiation process. (2) miR-125a are involved in the regulation of RANKL and M / CSF induced osteoclast differentiation, over expression of miR-125a significantly inhibited the expression of mRNA and CD+14PBMCs TRAP and NFATc1 to differentiate into osteoclasts. (3) miR-125a direct effect on target gene expression of tumor necrosis factor related factor 6 (TRAF6), TRAF6 is a transcription factor of the RANKL/RANK/NFATc1 signaling pathway, overexpression of miR-125a decreased the protein expression level of TRAF6, but no significant change of TRAF6 mRNA level were found.ConclusionIt proved that the miR-125a played an important role in the regulation of osteoclast differentiation by acting on the new TRAF6/NFATC1/miR-125a negative feedback control loop, expression and

regulation of miR-125a may become a new therapeutic target for metabolic bone diseases.

microRNA; Osteoclast; Transcription factor; Target gene; Negative feedback

湖南省自然科學基金(No.13JJ4119)

410016 長沙，湖南省馬王堆醫院老年內分泌科(楊麗、趙新蘭、廖斌、秦愛平)； 410010 中南大學湘雅二醫院 內分泌科(雷丹丹)

秦愛平，E-mail:qinaip@163.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.11.019

2014-08-12)