EMT與Ⅱ期結直腸癌復發轉移的相關性分析

曹傳培

EMT與Ⅱ期結直腸癌復發轉移的相關性分析

曹傳培

目的 探討E-cadherin、vimentin與Ⅱ期結直腸癌(colorectal cancer,CRC)復發轉移的關系。方法 選取Ⅱ期結直腸癌復發轉移與未復發轉移患者的組織切片，采用免疫組化技術檢測E-cadherin、vimentin的表達情況。結果 E-cadherin、vimentin表達與復發轉移有關。結論 E-cadherin、vimentin可能作為Ⅱ期CRC復發轉移的分子標志物。

Ⅱ期結直腸癌；上皮間質轉化；復發轉移；預后

(ThePracticalJournalofCancer,2014,29:1538～1539)

Ⅱ期(T3-4N0M0) CRC占全部CRC的40%，5年生存率為70%～85%，仍有近20%的Ⅱ期CRC患者在根治術后會出現復發轉移[1-2]。TNM分期是判斷CRC預后的良好依據，因患者存在個體異質性，所以即使同一分期的患者實行規范的治療后仍可能有不同的預后。而復發轉移是造成Ⅱ期CRC預后差的主要原因，研究Ⅱ期CRC患者復發轉移的高危因素及相關分子標記物可以補充分期系統的不足，并對基于腫瘤個體生物學特征的治療提供理論依據。

上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是腫瘤發生侵襲轉移的早期事件而受到廣泛關注。EMT是指在特定情況下上皮細胞向間充質細胞轉化的現象。EMT可以破壞腫瘤細胞間連接，使細胞間粘附性減弱，遷移能力增強[3]。EMT重要標志為E-cadherin表達下調及Vimentin表達上調。

本實驗旨在探索EMT在Ⅱ期CRC復發轉移中的作用，為尋找結直腸癌診斷治療新靶點提供理論依據，并指導臨床個體化治療。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2003年1月-2007年12月在九江學院附屬醫院行根治術的Ⅱ期結直腸腺癌患者86例。入選標準：①依據TNM分期標準，均為Ⅱ期；②術前未接受放化療；③接受標準根治性手術治療；④術后復發轉移情況明確；⑤病歷資料完整。

1.2 主要試劑

一抗：E-cadherin(SC-8426)及Vimentin(BM0135)購自武漢博士德公司，DAKO Real Envision anti mouse/rabbit 二抗檢測系統購自基因公司，進口羊血清工作液、一抗稀釋液購自中杉金橋公司。

1.3 免疫組織化學染色

采用Envision法檢測E-cadherin、vimentin的表達，將組織切片以4 μm厚度切片置于60 ℃恒溫箱過夜；二甲苯常規透明后以100%-100%-95%-95%-90%-80%-70%各級乙醇浸泡10 min,超純水浸泡5 min；高溫高壓抗原修復，從排氣閥開始排氣時算起3 min，自然冷卻；超純水浸泡2次，PBS浸泡2次，3 min/次，以洗去修復液；免疫組化油筆圈住組織防漏，3%過氧化氫室溫封閉10 min；放入PBS浸洗3次，5 min/次；滴加封閉血清封閉10 min；

一抗孵育：用吸水紙吸去血清，加稀釋的一抗溶液(1∶100)，37 ℃孵育1 h；傾去一抗，PBS浸洗3次，5 min/次；滴加Dako二抗，將組織完全覆蓋，平放于濕盒，室溫孵育30 min；傾去二抗，PBS浸洗3次，5 min/次；DAB顯色；蘇木精復染2 min，超純水中返藍1 h；70%-80%-90%-95%-95%-100%-100%乙醇；二甲苯透明10 min；中性樹膠封片；光鏡下觀察結果。

1.4 免疫組化染色結果觀察及判斷

采用光鏡下半定量法對陽性細胞染色強度及范圍進行判定：以染色強度分為：無(0分)；淺黃色(1分)；棕黃色(2分)；棕褐色(3分)。以陽性細胞數比例分為：陰性(0分)，<10%(1分)，10%～50%(2分)，51%～75%(3分)，76%～100%(4分)。免疫組化染色結果為上述兩項評分之積，<6分為低表達組，≥6分為高表達組(Vimentin表達于細胞間質，將計數陽性細胞比例改變為估算陽性細胞表達面積百分比，計分方法同上)。

1.5 統計學分析

應用SPSS 13.0軟件對結果進行統計學分析；分析各分子表達量與復發轉移的關系采用卡方檢驗；以α=0.05(雙側)為標準，以P<0.05為有統計學意義。

2 結果

在制作免疫組化染色過程中，出現掉片、卷片等不可評價共5例，這5例樣本無法完成分子指標檢測，最后納入分析的病例共81例。

2.1 復發轉移情況

在統計的81例患者中，16例(19.8%)復發轉移。根治術后2年內復發轉移率占56.3%(9/16)，3年內出現復發轉移占87.5%(14/16)。術后復發轉移中位時間為20個月。

2.2 E-cadherin、vimentin在Ⅱ期CRC 中表達情況

E-cadherin在CRC腫瘤組織中主要表達于細胞質或胞質、胞膜混合表達，腫瘤組織中其表達率為53.1%(43/81)，高表達者占16%(13/81)，低表達者占84%(68/81)。Vimentin表達于細胞間質，表達率為64.2%(52/81)，高表達者占40.7%(33/81)，低表達者占59.3%(48/81)。

2.3 復發轉移與E-cadherin、vimentin表達的關系

以復發轉移為終點事件，采用單因素卡方檢驗分析術后各分子表達量與復發轉移的關系，分析得出腫瘤復發轉移與E-cadherin(P=0.009)、vimentin(P=0.048)表達有關，見表1。

表1 各分子表達情況與復發轉移的關系/例

3 討論

EMT重要標志為E-cadherin表達下調，E-cadherin屬于I型鈣粘蛋白，介導鈣離子依賴性的同型上皮細胞間的黏附,限制細胞的隨意運動[4]。E-cadherin表達水平下降、喪失或分布異常,有利于腫瘤細胞侵襲轉移[5]。Xiaobing等[6]研究顯示E-cadherin在維持細胞間粘附性有重要作用，若E-cadherin表達缺失，會增加CRC細胞的侵襲性。

EMT另一個重要標志是波形蛋白(vimentin)表達上調，vimentin是由310個氨基酸殘基組成的III型中間纖維絲蛋白，與微管、微絲共同組成細胞骨架以維持細胞的形態及結構，參與腫瘤細胞的遷移、黏附、凋亡。研究表明vimentin選擇性高表達于侵襲性強的乳腺癌細胞中，并且與細胞角蛋白呈正相關性[7]。在惡性黑色素瘤和前列腺癌中也發現vimentin的過表達與腫瘤的侵襲性呈正相關[8-9]。

綜上所述，探尋更多復發轉移相關腫瘤標志物對于監測復發轉移、判斷預后及個體化治療非常重要，若能提前干預可以減少復發轉移率，對于提高Ⅱ期CRC總生存有重要意義。本研究發現E-cadherin、vimentin可能作為復發轉移的分子標志物。

[1] Wolpin BM,Mayer RJ.Systemic treatment of colorectal cancer〔J〕.Gastroenterology,2008,134(5):1296-1310.

[2] Gill S,Loprinzi CL,Sargent DJ,et al.Pooled analysis of fluorouracil-based adjuvant therapy for stage Ⅱ and Ⅲ colon cancer:who benefits and by how much〔J〕.J Clin Oncol，2004,22(10):1797-1806.

[3] Yilmaz M,Christofori G.EMT,the cytoskeleton,and cancer cell invasion〔J〕.Cancer Metastasis Rev,2009,28(1-2):15-33.

[4] Conacci-Sorrell M,Zhurinsky J,Ben-Ze'ev A.The cadherin-catenin adhesion system in signaling and cancer〔J〕.J Clin Invest,2002,109(8):987-991.

[5] Chen X,Wang Y,Xia H,et al.Loss of E-cadherin promotes the growth,invasion and drug resistance of colorectal cancer cells and is associated with liver metastasis〔J〕.Mol Biol Rep,2012,39(6):6707-6714.

[6] Herrmann H,Hesse M,Reichenzeller M,et al.Functional c- omplexity of intermediate filament cytoskeletons:from structure to assembly to gene ablation〔J〕.Int Rev Cytol,2003,223:83-175.

[7] Thomas PA,Kirschmann DA,Cerhan JR,et al.Association between keratin and vimentin expression,malignant phenotype,and survival in postmenopausal breast cancer patients〔J〕.Clin Cancer Res,1999,5(10):2698-2703.

[8] Singh S,Sadacharan S,Su S,et al.Overexpression of vimentin:role in the invasive phenotype in an androgen-independent model of prostate cancer〔J〕.Cancer Res,2003,63(9):2306-2311.

[9] Brabletz T,Hlubek F,Spadena S,et al.Invasion and metastasis in colorectal cancer:epithelial-mesenchymal transition,mesenchymal-epithelial transition,stem cells and b-catenin〔J〕.Cells Tissues Organs,2005,179(1-2):56-65.

(編輯：吳小紅)

Correlation Research between EMT and Recurrence and Metastasis of Stage ⅡColorectal Cancer

CAOChuanpei.

JiujiangUniversityHospital,Jiujiang,332000

Objective To explore the relationship between E-cadherin,vimentin and recurrence and metastasis of stage Ⅱ colorectal cancer.Methods Expression of E-cadherin and vimentin in stage Ⅱ colorectal cancer patients with and without recurrence and metastasis were detected by immunohistochemical technique.Results Multivariate analysis showed that the recurrence and metastasis of stage Ⅱ colorectal cancer was significantly associated with E-cadherin and vimentin expression (P<0.05).Conclusion E-cadherin and vimentin may be used as a molecular biomarker for predicting the recurrence and metastasis of stage Ⅱ colorectal cancer.

Stage Ⅱ colorectal cancer；Epithelial-to-mesenchymal transition(EMT)；Recurrence and metastasisⅡPrognosis

332000 九江學院附屬醫院普外科

10.3969/j.issn.1001-5930.2014.12.009

R735.3+7

A

1001-5930(2014)12-1538-02

2014-09-17

2014-10-30)