血漿EB病毒DNA檢測對鼻咽癌診斷的價值研究

陳文學 鄒學森 李金高 龔小昌 袁 霞 敖 帆

血漿EB病毒DNA檢測對鼻咽癌診斷的價值研究

陳文學 鄒學森 李金高 龔小昌 袁 霞 敖 帆

目的 探討血漿 EB病毒水平對鼻咽癌的診斷價值。方法 收集112例鼻咽癌初診患者外周血,分離血漿,應用熒光定量 PCR法檢測 EB病毒 DNA。結果 血漿中EB病毒DNA陽性率與患者性別無相關性。30-60歲鼻咽癌患者血漿中EB病毒DNA陽性率明顯高于60歲以上者(P<0.05)。鼻咽癌患者血漿EB病毒DNA陽性率為74.11%，隨著鼻咽癌患者臨床分期增加，血漿中EB病毒DNA陽性亦增強。結論 血漿EB病毒DNA水平與鼻咽癌患者臨床分期呈正相關關系，血漿EB病毒DNA的檢測可以輔助鼻咽癌的診斷。

鼻咽癌;Epstein-Barr病毒;DNA

(ThePracticalJournalofCancer,2014,29:1526～1528)

EB病毒感染是鼻咽癌的發生的高危因素，眾多研究顯示鼻咽癌組織和鼻咽癌轉移的淋巴結中均可檢出EB病毒[1]。1998年Mutirangura等[2]報道鼻咽癌患者外周血中可以檢測到EB病毒DNA，且拷貝數明顯高于正常人。外周血EB病毒DNA檢測可能成為鼻咽癌早期診斷的一種方法。我們運用熒光定量PCR方法檢測江西省112例鼻咽癌初診患者血漿中游離EB病毒DNA，分析在鼻咽癌診斷。

1 材料與方法

1.1 研究對象

2012年3月-2013年12月本院收治的鼻咽癌初治患者112例,平均年齡 48.5 (21～72)歲。全部患者經鼻咽活檢病理證實為鼻咽癌，病理類型均為低分化鱗癌。所有患者均接受鼻咽、頸部CT掃描，電子鼻咽鏡及胸部正側位片，腹部B超及相關實驗室檢查以明確分期及遠處轉移，若患者有骨痛癥狀則行全身骨掃描。臨床分期按92分期標準進行TNM分期。

抽取患者2 ml外周血置于 EDTA抗凝管，全血經3 000轉/分鐘離心，分離獲得血漿，-20 ℃保存備用。

1.2 試劑和儀器

EB病毒核酸擴增熒光檢測試劑盒(中山大學達安基因股份有限公司)，熒光定量核酸擴增儀( 達安基因DA7600)。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取 嚴格按照EB病毒核酸擴增熒光檢測試劑盒說明書操作進行DNA提取。取50 μl血漿置滅菌管中，加入50 μl DNA提取液，充分混勻，100℃恒溫處理(10±1) min，4℃過夜，次日12 000轉離心5 min，-20 ℃保存備用。

1.3.2 引物探針及反應體系 所擴增的目的片段來自EB病毒的EBNA-1片段。上游引物，下游引物及探針由達安基因試劑盒自帶，探針序列5′標記熒光發射基團FAM，3′標記熒光淬滅基團TAMRA。

1.3.3 反應循環參數設置 93 ℃，2 min；93 ℃，45 s，55 ℃，60 s，10個循環；93 ℃，30 s，55 ℃，45 s(采集熒光信號)，30個循環。

1.3.4 反應的質量控制 每次操作都做EBV陰性質控品，EBV臨界陽性質控品，EBV強陽性質控品，定量參考品(107IU/ml,106IU/ml,105IU/ml,104IU/ml，103IU/ml)。PCR擴增結束后，EBV陰性質控品為陰性，EBV臨界陽性和強陽性質控品在質控范圍內，定量參考品的相關系數在0.98以上，此實驗有效，如果有一項不在范圍內，實驗無效，重做。

1.3.5 判斷標準 所有定量結果分為四個等級，陰性≤500 IU/ml，弱陽性501～20 000 IU/ml，陽性20 001～1 000 000 IU/ml,強陽性≥1 000 001 IU/ml。

1.4 統計分析

應用SPSS 10.0軟件進行統計學分析。不同性別組、年齡組中鼻咽癌患者EB病毒陽性率的比較用卡方檢驗，鼻咽癌患者EB病與臨床分期的相關性采用Spearman 相關秩和檢驗。

2 結果

2.1 定量標準曲線的建立

實時熒光定量PCR儀在每個循環檢測一次熒光信號，熒光信號的多少與PCR的產物量呈正相關關系。PCR反應結束后，實時熒光定量PCR儀會自動給出PCR擴增的動力曲線(圖1)及定量PCR的標準曲線,分別為107、106、105、104、103IU/ml(圖2)。圖2中標準曲線的斜率為-3.42，相關系數為0.999。

圖1 PCR擴增的動力曲線

2.2 EB病毒感染與鼻咽癌與鼻咽癌患者臨床參數的關系

112例鼻咽癌初診患者中年齡最大的72歲，最小的21歲，40～49歲占34.82%(39/112)，其次為50～59歲占26.79%(30/112)。由表1可見，鼻咽癌初診患者的年齡與EB病毒感染率有顯著相關性(χ2=17.799P=0.001)。進行各年齡組兩兩比較，結果50～59歲組EB病毒陽性率明顯高于60～69歲組，40～49歲組與60～69歲組比較(χ2=7.163P=0.007)、50～59歲與60～69歲組比較(矯正χ2=15.386P=0.0000)EB病毒的陽性率有統計學意義，見表1。

圖2 PCR的標準曲線

男性鼻咽癌初治患者的EB病毒陽性率與女性相比無顯著性差異(χ2=0.19,P=0.663)。

表1 鼻咽癌初診患者年齡對EB病毒感染的影響/例

2.3 鼻咽癌初診患者EB病毒陽性與其臨床分期的關系

112例鼻咽癌初診患者外周血EB病毒陽性率為74.11%(89/112)，其中強陽性16例(14.29%)，陽性47例(41.92%)，弱陽性20例(18.76%)。最高拷貝數為大于1×107，中位拷貝數為4.05×105。所有鼻咽癌初診患者按照92分期標準進行了TNM分期(表2)。Ⅰ期與Ⅱ期，Ⅲ期與Ⅳ期鼻咽癌患者外周血EB病毒陽性率比較均無顯著性差異，Ⅰ期與Ⅲ期(Fisher's Exact TestP=0.0013)、Ⅰ期與Ⅳ期(Fisher's Exact TestP=0.002)、Ⅱ期與Ⅲ期(矯正χ2= 6.973,P=0.008)、Ⅱ期與Ⅳ期(矯正χ2=7.285,P=0.007)比較均有顯著性差異。將Ⅰ期和Ⅱ期歸類為早期鼻咽癌，Ⅲ期和Ⅳ期歸類為晚期鼻咽癌，經過卡方檢驗，發現Ⅲ期和Ⅳ期外周血EB病毒陽性率明顯高于Ⅰ期和Ⅱ期(矯正χ2=17.56,P=0.000)。對鼻咽癌患者臨床TNM分期與外周血EB病毒含量做Spearman相關秩和檢驗(γ=0.345,P=0.000)，結果說明鼻咽癌患者TNM分期與外周血EB病毒含量呈正相關關系。

表2 不同臨床分期鼻咽癌患者外周血EB病毒 DNA水平

3 討論

熒光定量 PCR技術是近年來新興的分子診斷方法。它具有常規PCR的高靈敏性，克服了常規PCR 技術不能定量以及易污染的問題。熒光定量 PCR技術運用了熒光探針，可以直接探測到PCR擴增過程中熒光信號的變化，實現了實時定量。

我們應用熒光定量PCR技術檢測江西省內鼻咽癌初治患者血漿中EB病毒DNA，結果顯示鼻咽癌患者的陽性率為74.11%。Lo[3]運用熒光定量PCR方法檢測了57例鼻咽癌患者血漿EB病毒DNA，55例為陽性，陽性率96%。Shotelersuk[4]運用巢式PCR方法檢測167例鼻咽癌患者，87例為陽性，陽性率為52.1%。產生這種差異的可能原因為入組患者分期比例不同，使用的檢測方法不同，不同地區鼻咽癌患者EB病毒感染特征不同有關。

本研究結果顯示，EBV DNA陽性率男女之間無顯著性差異。30歲到60歲三個年齡組之間EB病毒DNA無顯著性差異，40～歲組與60～歲組EB病毒的陽性率比較時P值接近檢驗水準，50～歲組EB病毒的陽性率明顯高于60～歲組。文獻報道在鼻咽癌高發地區健康人群中EBV DNA感染與性別、年齡之間無相關關系。我們的研究結果顯示鼻咽癌患者血漿中EB病毒DNA年齡分布特征與鼻咽癌的人群年齡分布(20～40歲開始上升，40～60歲達到發病高峰)很相似，這也提示EB病毒感染與鼻咽癌的發生有密切關系，EB病毒感染是鼻咽癌發生的高危因素。究竟EB病毒感染在鼻咽癌發生中起了多少作用，EB病毒感染是從幼年開始，鼻咽癌發病是成年以后，在這漫長的過程中EB病毒是怎樣導致鼻咽癌發生的還有待于進一步研究。

本研究中分析了鼻咽癌患者血漿中 EBV DNA的含量與鼻咽癌分期的關系，結果顯示，血漿中EBV DNA與鼻咽癌患者臨床分期呈正相關關系，晚期鼻咽癌的EB 病毒含量明顯高于早期鼻咽癌患者。EB病毒在宿主細胞中有兩種存在方式，EB病毒或插入宿主細胞染色體中或以環狀分子游離于細胞DNA之外。鼻咽癌病人腫瘤細胞來源的EB病毒DNA釋放入血的機制目前尚不十分清楚。Chan等[5]研究發現血漿中EBV DNA不是完整的病毒顆粒而是裸露的DNA片斷，故推測血漿EBV DNA是由壞死的腫瘤細胞釋放入外周血。有學者認為鼻咽癌患者血清EBV DNA水平與腫瘤組織細胞凋亡有正相關性，提示外周血游離的EB病毒DNA是凋亡的腫瘤細胞釋放的。買世娟報道早期和晚期患者的外周血單個核細胞EB病毒陽性率分別為76.19%(16/21)和73.42%(58/79)，無明顯差異，但血清/血漿EB病毒陽性率分別為61.9%(13/21)和88.61%(70/79)，有明顯差異，提示血清/血漿中檢測到的EB病毒DNA是來源于腫瘤組織，并與局部腫瘤負荷有關。我們的研究結果說明隨著鼻咽癌的進展(腫瘤體積的增大或腫瘤轉移)血漿中 EBV DNA的陽性率亦增高，血清/血漿中檢出的游離的EB病毒DNA可能來源于含有EB病毒的腫瘤細胞或單核/巨噬細胞破裂而釋放病毒進入血循環。

綜上所述血漿中EBV DNA水平增高與鼻咽癌臨床分期、腫瘤負荷及病情相關。血漿EB 病毒 DNA定量檢測可作為鼻咽癌診斷的手段之一。

[1] 蔣衛紅，趙素萍，尹志華，等.定量和定位檢測EB病毒在鼻咽癌組織中的感染狀態〔J〕.癌癥,2005,24(7):796-800.

[2] Mutirangura A,Pornthanakasem W,Theamboonlers A,et al.Epstein-Barr viral DNA in serum of patients with nasopharyngeal carcinoma〔J〕.Clin Cancer Res,1998,4(3):665-669.

[3] Lo YM,Chan LY,Lo KW,et al.Quantitative analysis of cell-free Epstein barr virus DNA in plasma of patients with nasopharyngeal carcinoma 〔J〕.Cancer Res,1999,59(6):1188-1191.

[4] Shotelersuk K,Khorprasert C,Sakdikul S,et al.Epstein-Barr Virus DNA in Serum/Plasma as a Tumor Marker for Nasopharyngeal Cancer 〔J〕.Clin Cancer Res,2000,6(3):1046-1051.

[5] Chan KC,Zhang J,Chan AT,et al.Molecular characterization of circulating EBV DNA in the plasma of nasopharyngeal carcinoma and lymphoma patients 〔J〕.Cancer Res,2003,63(9):2028-2032.

(編輯：吳小紅)

Detection of EB Virus in Plasma in the Diagnosis of Nasopharyngeal Carcinoma

CHENWenxue,ZOUXuesen,LIJingao,etal.

JiangxiCancerHospital,Nanchang,330029

Objective To explore the diagnostic value of Epstein-Barr virus (EBV) DNA in plasma in nasopharyngeal carcinoma (NPC).Methods Real time quantitative PCR was used to detect EBV DNA in plasma of 112 cases of first diagnosed nasopharyngeal carcinoma.Results EBV DNA positive rate of NPC had no correlation with gender.The EBV DNA positive rates of patients from 30 to 60 years old were higher than those of patients over 60(P<0.05).EBV DNA positive rate in NPC plasma was 74.11%.With the increase of NPC clinical stage,the EBV DNA positive rate increased.Conclusion The EBV DNA level of plasma and NPC clinical stage has a positive relationship.Detection of plasma EBV DNA is useful for the diagnosis of NPC.

Nasopharyngeal carcinoma (NPC);Epstein-Barr virus (EBV);DNA

330029 江西省腫瘤醫院

10.3969/j.issn.1001-5930.2014.12.005

R739.62

A

1001-5930(2014)12-1526-03

2014-08-21

2014-09-28)