可溶性環氧化物水解酶基因多態性與冠心病的相關性

黃一偉，張懷勤，林斌，王軍，毛義建

近年來，隨著人民生活水平的提高，我國冠心病的發病率和病死率也逐年提高，并呈年輕化趨勢。冠心病目前被認為是一種由各種高危因素（疾病）和多個遺傳因素共同作用而發病的多基因遺傳性疾病，其中內皮功能障礙與冠心病的發病、進展密切相關[1]。可溶性環氧化物水解酶（EPHX2）是通過水解體內的環氧二十碳烯酸（EETs）來調節血管內皮功能[2]。近年來多項國內外研究發現EPHX2基因位點的多個單核苷酸多態性（SNP）與多種心血管疾病存在相關性[3-5]，其中rs751141 G/A多態性與原發性高血壓病、冠心病的關系之前已有報道[6]。本研究通過對176例冠心病患者與179例經皮冠狀動脈造影（CAG）顯示正常者EPHX2基因rs2271001 A/G位點的多態性進行檢測，探討其與中國浙江籍漢族人群冠心病的相關性。

1 對象和方法

1.1 研究對象 選擇2010年8月至2013年3月在我院心血管內科住院的患者共355例，入選對象均為浙江籍漢族且無親緣關系，排除惡性腫瘤、外周血管病、腦血管病。記錄患者的年齡、性別、家族史、身體質量指數（BMI）等基本資料和冠心病危險因素如有無吸煙史、血漿總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）水平。所有患者均經CAG檢查，以冠狀動脈任何一支血管直徑狹窄程度≥50%為陽性。根據造影結果分為2組：冠心病組，CAG結果陽性，共176例，男135例，女41例，年齡44～88歲，平均（64.12±10.22）歲；對照組，CAG結果陰性，共179例，男118例，女61例，年齡32～84歲，平均（60.01±11.50）歲。冠心病組與對照組臨床資料比較見表1。

表1 冠心病組與對照組臨床資料比較（ ±s）

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取：抽取約5 mL空腹靜脈血，使用1×RBC裂解液、1×細胞核裂解液、20%十二烷基磺酸鈉（SDS）、蛋白酶K、Tris飽和酚、氯仿、無水乙醇、70%乙醇、TE緩沖液等，通過常規酚/氯仿抽提法提取所有患者外周血白細胞DNA，稀釋DNA樣本并用紫外可見分光光度儀檢測樣本濃度，-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 基因位點檢測方法：設計上游引物：5’-GCTT CTTCATTGGGCTGCTA-3’，下游引物：5’-TGAGACTTCC CATTCTCTTCTGA-3’（購自上海生工生物工程有限公司）。PCR擴增體系：總反應體積20μL，終濃度為10 ng/μL的基因組DNA 1μL，終濃度為4μM/μL的上、下游引物各1μL。PCR反應條件為：95 ℃變性 2 min后進行PCR循環，PCR循環參數為95 ℃ 5 min、 95 ℃ 50 s、60 ℃ 50 s，共40個循環，擴增結束后 設置4 ℃保溫。將PCR管置于ABI 2720 PCR儀上進行 擴增。PCR產物應用Sanger法進行測序，反應體系為：總反應體積5μL，PCR純化產物1μL，Bigdye3.1 （終止子循環測序反應染料，購自ABI公司）1μL，測序分型試劑盒提供的測序引物1μL（購自上海生工生物工程有限公司），反應條件為：98 ℃變性2 min 后進行PCR循環，PCR循環參數為96 ℃ 10 s、50 ℃ 50 s、60 ℃ 4 min，共25個循環，擴增結束后設置4 ℃保溫。測序PCR反應產物采用醋酸鈉/乙醇法純化，純化產物在ABI 3100遺傳分析儀上進行測序，測序結果用CHROMAS軟件分析。

1.3 統計學處理方法 應用SPSS19.0軟件進行統計分析。計量資料采用±s表示，2組間均數比較采用t檢驗；基因型和等位基因頻率采用頻率計數法計算；基因型資料采用Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗；單個基因型及組間等位基因頻率比較采用x2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EPHX2基因rs2271001 A/G多態性分析 選取各種不同基因型PCR產物進行測序，結果見AA、AG、GG 3種基因型分布（見圖1）。冠心病組與對照組的EPXH2基因rs2271001位點基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg檢驗，冠心病組與對照組基因型的觀察數與期望數差異均無統計學意義（均P＞0.05）。見表2。說明本研究人群對rs2271001 A/G位點有較好的群體代表性。

圖1 EPHX2基因rs2271001 A/G測序結果

表2 EPHX2基因rs2271001 A/G基因型頻率及遺傳平衡吻合度檢驗 n（%）

2.2 等位基因與基因型頻率分布 冠心病組和對照組EPHX2基因rs2271001 A/G多態性檢測結果顯示，對照組中GG、AG和AA基因型頻率分別為5.59%、7.82%和86.59%，G、A等位基因頻率分別為9.50%、90.50%。而在冠心病組中GG、AG和AA基因型頻率分別為12.50%、11.93%和75.57%，G、A等位基因頻率分別為18.47%、81.53%。2組間基因型頻率分布和等位基因G、A的頻率分布差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見表3。

表3 2組EPHX2基因rs2271001位點基因型與等位基因頻率分布 n（%）

3 討論

EPHX2和細胞色素P450 2C9共同集中分布于人體許多組織中，細胞色素P450 2C9是將花生四烯酸轉化為環氧二十碳三烯酸（EETs）的主要亞型，而EETs在抗血小板、抗炎、舒張血管、抑制血管平滑肌細胞移形、調節脂質代謝和胰島素抵抗等方面具有重要的作用[7-9]。EETs主要經EPHX2水解成二羥基衍生物而失去生物學活性。故EPHX2通過水解EETs達到調節細胞和EETs活性的作用。EPHX2由兩個富含不同羥脯氨酸多肽結構域組成的同型二聚體[10]， 每個單體的兩個多肽結構區域均能選擇性地催化、水解環氧化物，C-末端區域含有典型的α/β-水解酶折疊結構，具有環氧化物水解酶活性；N-末端區域具有脂質磷酸酶活性，經動物實驗研究及流行病學研究表明，其在降膽固醇、抗炎、預防心血管疾病以及穩定EPHX2活性方面發揮重要作用[11-12]。近幾年來，越來越多的EPHX2抑制劑被用于冠心病患者。許丹焰等[13]發現使用EPHX2抑制劑可促進冠心病患者新生血管的形成和損傷內皮的修復，作用機制可能是通過加強血管通透性因子的活性，正向調節成血管細胞，參與內皮修復和血管再生。EPHX2抑制劑可能為今后冠心病的防治提供新思路，其具體機制及遠期療效有待進一步研究。

人類EPHX2具有多態性，包括5c側翼區的插入/缺失多態構象，不同的基因類型表達不同的EPHX2活性產物。近年來多項EPHX2多態性研究發現，EPHX2的活性跟R287Q及K55R突變相關[3，6]；美國的社區動脈粥樣硬化研究也發現高加索人種冠心病的發病風險與EPHX2基因rs2271001位點多態性存在相關[4]。本研究發現在中國浙江籍漢族人群中，冠心病組和對照組rs2271001位點基因型頻率分布差異有統計學意義（P＜0.05），并且冠心病組G與A等位基因的頻率分布與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），G等位基因頻率（為18.47%）明顯高于對照組（為9.50%），提示rs2271001位點多態性與冠心病的發病率相關，G等位基因可能是中國浙江籍漢族人群冠心病發病的易感因素之一。此外，我們在吸煙患者中發現rs2271001位點變異更為多見，這與吸煙導致血管內皮功能障礙、為冠心病重要的危險因素之一相符合，但是兩者是否存在相關性還有待進一步研究證實。