順鉑聯合吡柔比星對腦膠質瘤U87細胞株增殖的抑制作用

虞歡東++++++于海濤++++++夏建國++++++李軍++++++丁鴻飛++++++周紅建++++++裴靜波

[摘要] 目的 觀察順鉑（CDDP）聯合吡柔比星（THP）對腦膠質瘤U87細胞株增殖的抑制作用。 方法 采用MTT法檢測不同濃度CDDP、THP以及兩者聯合應用時對U87細胞增殖作用的影響。 結果 隨藥物濃度增加，CDDP組、THP組和聯合組對U87細胞增殖抑制作用逐漸增強（均P<0.01）。聯合組對U87細胞增殖抑制率較同濃度CDDP組、THP組明顯增加（P<0.05或P<0.01）。當CDDP和THP濃度為≤0.625μg/mL時，聯合組Q值分別為1.72、1.31，兩藥聯合應用具有協同作用，當CDDP和THP濃度≥1.25μg/mL時，聯合組Q值分別為0.94、0.88、0.86、0.89，兩藥聯合應用具有相加作用。 結論 CDDP聯合THP較單純的CDDP或THP抑制U87細胞增殖作用更強，具有濃度依賴性。在較低劑量下就能達到明顯腫瘤抑制效應，對殺傷U87細胞具有確切協同效應。

[關鍵詞] 腦膠質瘤；MTT；順鉑；吡柔比星；增殖

[中圖分類號] R739.4[文獻標識碼] A[文章編號] 1673-9701（2014）15-0001-03

Inhibition effect of cis-diaminedichloroplatinum(CDDP) combined with pirarubicin (THP) on cell proliferation of brain glioma U87

YU Huandong YU Haitao XIA Jianguo LI Jun DING Hongfei ZHOU Hongjian PEI Jingbo

Encephalopathy Center, Xiaoshan Traditional Chinese Medicine Hospital of Hangzhou, Hangzhou 311200, China

[Abstract] Objective To discuss inhibition effect of cis-Diaminedichloroplatinum (CDDP) combined with Pirarubicin (THP) on cell proliferation of brain glioma U87. Methods The MTT method was applied to detect the cell proliferation of brain glioma U87 in the influence by CDDP, THP and the combination of both under different concentration. ResultsAs the concentration of drugs rose, the influences on inhibition of cell proliferation of brain glioma U87 in CDDP group, THP group and combination group were enhanced gradually(P<0.01 on average). Compared with CDDP group and THP group under the same concentration, the inhibitory rate of cell proliferation obviously rose (P<0.05 or P<0.01). When the concentration in CDDP group and THP group was no more than 0.625μg/mL, the Q value in combination group were 1.72 and 1.31 respectively, which showed the coordination effect of combination of these two drugs. When the concentration in CDDP group and THP group was no less than 1.25μg/mL, the Q value in combination group were 0.94, 0.88, 0.86 and 0.89 respectively, which showed the additive effect of combination of these two drugs. ConclusionCompared with separate CDDP or THP, the combination of both CDDP and THP has more favorable inhibition of cell proliferation of brain glioma U87, with concentration dependent, which can achieve obviously tumor suppression effect under low dose, and has definitive coordination effect to kill and wound U87 cells.

[Key words] Brain glioma; MTT; Cis-Diaminedichloroplatinum(CDDP); Pirarubicins(THP); Proliferation腦膠質瘤是神經外科最常見的惡性疾病，約占顱內腫瘤的40％～50％[1]。腦膠質瘤的治療方式以手術切除為主，術后常予以輔助性化療，其中以順鉑為主的聯合化療是其目前常用的一線治療方案[2,3]。由于腫瘤對化療藥的敏感性有很大差異，因此，腦膠質瘤的最佳化療方案應是針對不同腫瘤特征為依據，選擇較敏感化療藥進行個體化綜合治療。本研究觀察了順鉑（CDDP）聯合吡柔比星（THP）對腦膠質瘤細胞株U87細胞的增殖抑制作用，探討兩藥在合適濃度下的協同抑制作用。現報道如下。

1材料與方法

1.1材料

腦膠質瘤細胞株U87由華中科技大學同濟醫學院腦外科實驗室提供。胎牛血清、RPMI1640購于美國Sigma公司。CDDP、THP分別購于齊魯制藥公司（國藥準字H37021358）和深圳萬樂藥業公司（國藥準字H10930105）。MTT細胞增殖分析試劑為Promega公司產品，全波長酶標儀為Thermo公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及試劑配置腦膠質瘤細胞株U87細胞使用RPMI1640培養液（含10%胎牛血清），于37℃、5%CO2條件下培養箱中進行培養，定期更換培養液，待U87細胞增殖融合達80%左右進行消化傳代。CDDP用PBS液配制成1mg/mL的儲存液，THP用PBS液配制成1mg/mL儲存液，儲存于-70℃冰箱保存待用。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖抑制率[2] 取對數生長期的U87細胞，將U87細胞的濃度調至1.5×104/mL，每孔100μL接種于96孔板中，CDDP組、THP組、聯合組分別加入不同濃度（10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125）μg/mL的藥物（每個濃度各設3個復孔），其中聯合組根據兩藥同濃度進行相互組合。另外設置細胞空白對照組、藥物單用組和聯合藥物組，各藥物組設6個濃度水平，采用常規MTT法測定U87細胞的增殖抑制率。

1.2.3 協同作用Q值的測定[4,5]根據金正均的概率和法計算其Q值，Q=E（A+B）/[EA + （1-EA）×EB]，其中E（A+B）、EA和EB分別為兩藥聯合作用時和兩藥單獨作用時的U87細胞增殖抑制率。當計算的Q值為0.85～1.15時，表明兩藥聯合具有相加作用；當計算的Q值>1.15時，兩藥聯合具有協同作用；當計算的Q值<0.85時，表示兩藥聯合具有拮抗作用。

1.3 統計學方法

應用SPSS18.0 for windows軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組內和組間差異比較均采用方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTT檢測三組藥物培養48h時對U87細胞的增殖抑制率

培養48h時，隨著藥物濃度的增加，CDDP組、THP組和聯合組對U87細胞的增殖抑制作用逐漸增強， 差異有統計學意義（均P<0.01）。聯合組對U87細胞增殖抑制率較同濃度CDDP組、THP組明顯增加， 差異有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。見表1。

2.2 CDDP和THP聯合用藥的協同作用結果分析

當CDDP和THP濃度為0.3125μg/mL、0.625μg/mL時，聯合組的Q值分別為1.72、1.31，表示兩藥聯合應用具有協同作用（Q>1.15）；當CDDP和THP濃度1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL時，聯合組的Q值分別為0.94、0.88、0.86、0.89，表示兩藥聯合應用具有相加作用（Q值為0.85～1.15）。

3 討論

神經膠質瘤是腦外科較常見的原發性的腦部腫瘤，具有高發病率、高復發率和低治愈率的特點，預后相對較差，死亡率較高[6,7]。神經膠質瘤主要來源于神經間質細胞，包括星形細胞瘤（Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級和Ⅳ 級）、少突神經膠質細胞瘤和混合型神經膠質瘤[8,9]。神經膠質瘤的治療方式以手術切除治療為主，但因神經膠質瘤其分化差、增殖快，常呈浸潤性生長，與正常的腦組織間邊界不是很清楚，多數不限于一個腦葉，向腦組織外呈指狀深入破壞腦組織,往往難以作到全部手術切除，一般均主張綜合治療[10-12]。目前臨床上一般主張進行手術切除、術后放療和化療等綜合治療，尤其術后輔助化療是預防其復發的關鍵，以延緩其復發和延長患者的生存時間，而聯合用藥可以增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性[13-15]。

CDDP是常用神經腫瘤化療藥物之一，具有較強的抗癌活性，其機制主要是CDDP作為鉑的金屬絡合物，進入癌細胞后逐漸水化成反式并水解，主要作用于DNA的鏈間和鏈內的交鏈結構，干擾癌細胞DNA的復制，導致腫瘤細胞死亡[16,17]。THP為細胞周期非特異性藥物，其機制主要是THP分子很快進入核內，抑制DNA聚合酶，阻止核酸合成；藥物嵌入DNA雙螺旋鏈，使腫瘤細胞中止于G2期，導致細胞死亡。在單用CDDP或THP進行神經膠質瘤術后輔助化療時，臨床療效不甚滿意，這可能與腫瘤細胞的耐藥性有關。腫瘤耐藥機制與NF-κB的一些目標基因包括炎性因子基因、抗凋亡基因和多藥耐藥基因等眾多影響細胞生長與凋亡的基因激活有關[18,19]。孫淑清等[20]證實腦膠質瘤中P170、MGMT、TOPII等蛋白表達與化療藥物敏感性密切相關，可指導臨床選擇合理化療藥物。本研究結果發現，隨藥物濃度增加，CDDP組、THP組和聯合組對U87細胞增殖抑制作用逐漸增強，且聯合組對U87細胞增殖抑制率較同濃度CDDP組、THP組明顯增加，提示CDDP聯合THP較單純的CDDP或THP抑制U87細胞的增殖作用更強，具有濃度依賴性。同時研究發現當CDDP和THP濃度為≤0.625μg/mL時，Q>1.15，提示CDDP聯合THP兩藥聯合具有協同作用；當CDDP和THP濃度≥1.25μg/mL時，Q值為0.85～1.15，提示CDDP聯合THP具有相加作用。

總之，CDDP聯合THP較單純的CDDP或THP抑制U87細胞的增殖作用更強，具有濃度依賴性。在較低劑量下就能達到明顯腫瘤抑制效應，對殺傷U87細胞具有確切協同效應。

[參考文獻]

[1]Sathomsumetee， S， Rich JN. New approaches to primary brain tumor treatment[J]. Anticancer Drugs，2006，17（9）:1003-1016.

[2]尹宜發，楊凡，周海波，等. 順鉑聯合米托蒽醌調節腦膠質瘤U87細胞Sonic Hedgehog信號通路的研究[J]. 現代腫瘤醫學，2011，19（7）:1306-1309.

[3]劉鶯，張艷玲. 依托泊甙聯合順鉑治療食管小細胞癌的療效[J]. 腫瘤防治研究，2011，38（12）:1423-1425.

[4]金正均. 合并用藥中的相加[J]. 中國藥理學報，1980，1（2）:70-76.

[5]Liu F， Liu S， He S， et al. Survivin transcription is associated with P-plycoprotein /MDRI overexpression in the multidrug resistance of MCF-7 breast cancer cells[J]. Oncol Rep，2010，23（5）:1469-1475.

[6]Sathornsumetee S， Rich JN， Reardon DA. Diagnosis and treatment of high-grade astrocytoma[J]. Neurol Clin，2007， 25（4）:111-1139.

[7]Nobuhiro Mikuni，Susumu Miyamoto. Surgical treatment for glioma:extent of resection applying functional neurosurgery[J]. Neurol Med Chir（Tokyo），2010，50:720-726.

[8]Deorah S， Lynch CF， Slib ebenaller ZA， et al. Trends in brain cancer incidence and survival in the United States: Surveillance， Epidemiology， and End Resultes Program，1973 to 2001[J]. Neurosurg Focus，2006，20（4） :347-351.

[9]Zustovich F，Lombardi G，Della Puppa A，et al. A phase Ⅱ study of cisplatin and temozolomide in heavily pre-treated patients with temozolomide-refractory high-grade m alignant glioma[J]. Anticancer Res，2009，29（10）:4275-4279.

[10]Natsume A，Ishii D，Wakabayashi T，et al. IFN-beta downregulates the expression of DNA repair gene MGMT and sensitizes resistant glioma cells to temozolomide[J]. Cancer Res，2005，65（17）:7573-7579.

[11]Wen PY， Kesari S. M alignant gliomas in adults[J]. N Engl J Med 2008，359（5）:492-507.

[12]Louis DN， Holland EC， Cairncross JG. Glioma classification:a molecular reappraisal[J]. Am J Pathol， 2001， 159（3）: 779-786.

[13]Yaman E， Buyukberber S， Uner A， et al. Carboplatin and oral cyclophosphamide combination after temozolomide failure in m alignant gliomas[J]. Tumori，2008，94（5）:674-680.

[14]Massimino M， Spreafico F， Biassoni V， et al. Diffuse pontine gliomas in children:changingstrategies， changing results? A mono-institutional 20-year experience[J]. J Neurooncol， 2008， 87（3）:355-356.

[15]Stupp R，Mason W P，van den Bent M J，et al. Radiotherapyplus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma[J]. N Engl J Med，2005，352（10）:987-996.

[16]李燾，萬志先，羅然，等. LY294002聯合順鉑對腦膠質瘤U87細胞株增殖的影響[J]. 重慶醫學，2012，41（12）:3692-3694.

[17]周紅建，王雄偉， 汪雷，等. 多柔比星聯合順鉑對腦膠質瘤 U251 細胞株的作用[J]. 實用醫學雜志，2011，27（6）:947-949.

[18]周紅建，王雄偉，劉朝奇，等. 米托蒽醌聯合順鉑對腦膠質瘤 U87 細胞株的影響[J]. 中國神經精神疾病雜志，2011，37（4）:206-209.

[19]Asechi H， Hatano E， Nitto T， et al. Resistance to cisplatin-introduced apoptosis via P13K-dependent suevivin expression in a rat hepatoma cell line[J]. Int J Oncol， 2010，37（1）:89-96.

[20]孫淑清，徐莉，崔云，等. 膠質瘤中P170、MGMT、TOPII和GST-π的蛋白表達與化療藥物敏感性的研究[J]. 中華神經外科雜志，2008，24（7）:499-502.

（收稿日期：2013-12-17）