冠狀動脈結(jié)扎(孫絡(luò)疏失)模型大鼠血漿內(nèi)皮細(xì)胞活性因子及微血管舒縮因子的動態(tài)變化研究

張俊修 霍旺 王朋 李紹旦 劉毅 楊明會

·論著·

冠狀動脈結(jié)扎(孫絡(luò)疏失)模型大鼠血漿內(nèi)皮細(xì)胞活性因子及微血管舒縮因子的動態(tài)變化研究

張俊修 霍旺 王朋 李紹旦 劉毅 楊明會

目的探討冠狀動脈結(jié)扎(孫絡(luò)疏失)模型大鼠血漿血管疏縮因子內(nèi)皮素-1、血栓素B2、6-酮-前列腺素F1а、血管緊張素Ⅱ的變化規(guī)律。方法將心電圖正常的60只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、造模30分鐘組、造模1小時(shí)組、造模6小時(shí)組、造模12小時(shí)組、造模24小時(shí)組。通過結(jié)扎大鼠冠狀動脈前降支的方法造成急性心肌缺血模型(“孫絡(luò)疏失”模型)，假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。放射免疫法檢測血漿血管疏縮因子內(nèi)皮素-1、血栓素B2、6-酮-前列腺素F1а、血管緊張素Ⅱ水平。結(jié)果經(jīng)單因素方差分析LSD檢驗(yàn)，與假手術(shù)組比較，血漿血管疏縮因子內(nèi)皮素-1水平在造模1小時(shí)組、造模6小時(shí)組、造模12小時(shí)組顯著升高(P<0.05)，并于24小時(shí)恢復(fù)正常；血漿6-酮-前列腺素F1а水平在各個模型組均顯著下降(P<0.01或P<0.05)，于12小時(shí)達(dá)到最低水平；血漿血栓素B2水平在造模6小時(shí)組顯著升高(P<0.01)，而在造模12小時(shí)組、造模24小時(shí)組明顯下降(P<0.05)；血漿血管緊張素Ⅱ在造模30分鐘組、造模1小時(shí)組顯著降低(P<0.01或P<0.05)，于1小時(shí)達(dá)到最低，而造模6小時(shí)組、造模12小時(shí)組、造模24小時(shí)組則回升至正常水平。結(jié)論微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂導(dǎo)致的微血管舒縮因子異常分泌、動態(tài)平衡遭到破壞，在“孫絡(luò)疏失”急性期的病理變化過程中發(fā)揮重要作用。

孫絡(luò)疏失； 心肌缺血； 內(nèi)皮素-1； 血栓素B2； 6-酮-前列腺素F1а； 血管緊張素Ⅱ； 大鼠

中醫(yī)的“脈”具有雙重含義：既是經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)中以運(yùn)行血液為主要功能的重要組成部分，又是屬于奇恒之腑的獨(dú)立實(shí)體臟器。吳以嶺院士提出“脈絡(luò)—血管系統(tǒng)病”理論，確定了脈絡(luò)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)血液循環(huán)系統(tǒng)的相關(guān)性[1]，認(rèn)為絡(luò)氣虛滯與血管內(nèi)皮功能障礙是病變的基本病機(jī)，是脈絡(luò)絀急與血管痙攣、脈絡(luò)瘀塞與血管閉塞、脈絡(luò)瘀阻與動脈粥樣硬化的共同病理環(huán)節(jié)[2]。冠狀動脈微循環(huán)障礙是急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)經(jīng)皮冠狀動脈介入治療過程中常見的并發(fā)癥，是影響冠狀動脈微循環(huán)灌注的主要原因，是AMI患者遠(yuǎn)期預(yù)后不良和死亡率的獨(dú)立預(yù)測因子[3]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)針對冠脈微循環(huán)障礙的藥物治療效果有限，課題組提出“營衛(wèi)承制調(diào)平”理論，反映血管病變作為復(fù)雜性疾病在生理、病理、治療、轉(zhuǎn)歸不同階段的內(nèi)在規(guī)律[4]，以期發(fā)揮中醫(yī)藥整體調(diào)節(jié)與多靶點(diǎn)的優(yōu)勢，在冠狀動脈微循環(huán)障礙性疾病中做出一定的突破。本研究遵循課題組指導(dǎo)思想，通過結(jié)扎大鼠冠狀動脈前降支的方法建立心肌缺血即“孫絡(luò)疏失”模型，探討血管內(nèi)皮細(xì)胞活性因子及微血管舒縮因子的動態(tài)變化規(guī)律，為“脈絡(luò)—血管系統(tǒng)病”理論和“營衛(wèi)承制調(diào)平”理論認(rèn)識、治療冠狀動脈微循環(huán)障礙提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雄性SD大鼠60只，體重(220±20)g，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心，許可證號SCXK-(軍)2012-0004。每籠5只飼養(yǎng)于獨(dú)立通氣籠具系統(tǒng)內(nèi)。溫度(22±1)℃，濕度(50±5)%，每日明暗交替12小時(shí)。實(shí)驗(yàn)期間造模、取材等操作均在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行，添加飼料、換水等由專人負(fù)責(zé)管理。

1.2 主要試劑

烏拉坦(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號T2011110)；注射用青霉素鈉(華北制藥股份有限公司，批號F3047216)；血管疏縮因子內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)、血栓素B2(thromboxaneB2，TXB2)、6-酮-前列腺素F1а(6-keto-prostaglandin1α，PGF1α)、血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)放射免疫試劑盒，均購自北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司(批號20131021)。

1.3 主要儀器

電子秤(長沙湘平科技發(fā)展有限公司，EPS-2001)；小動物心電圖機(jī)(北京福田電子醫(yī)療儀器有限公司，F(xiàn)X-211)；動物呼吸機(jī)(上海奧爾科特生物科技有限公司，ALC-V9)；高速離心機(jī)(Perkin Elmer VICTOR X5)；超凈工作臺(北京長城空氣凈化工程公司)；SN-697B放射免疫計(jì)數(shù)器(上海原子核研究所日環(huán)儀器廠)。

2 研究方法

2.1 造模方法及分組

選取心電圖正常大鼠60只，隨機(jī)數(shù)字表法分成假手術(shù)組、造模30分鐘組、造模1小時(shí)組、造模6小時(shí)組、造模12小時(shí)組和造模24小時(shí)組?！皩O絡(luò)疏失”大鼠模型參照文獻(xiàn)[5]，大鼠以20%烏拉坦按5 ml/kg腹腔注射麻醉后，經(jīng)口氣管插管連接呼吸機(jī)，設(shè)定呼吸頻率80次/分、潮氣量15 ml/kg、呼吸比1∶1。于大鼠左側(cè)胸壁3～4肋間橫向開胸，暴露心臟，撕開心包膜，在冠狀動脈左側(cè)主干處，左心耳下方約2～3 mm處以左心耳與肺動脈圓錐間左冠狀靜脈主干為標(biāo)志結(jié)扎(假手術(shù)組只穿線，不接扎)，進(jìn)針深度約1～1.5 mm，寬約2.0 mm，逐層關(guān)閉胸腔，待大鼠自主呼吸恢復(fù)后，移除呼吸機(jī)。以室壁運(yùn)動減弱，結(jié)扎下部心肌組織顏色變白，心電圖可見胸前各個導(dǎo)聯(lián)的ST段抬高、T波高聳為造模成功標(biāo)志，造模后每只大鼠一次性注射青霉素鈉40萬單位預(yù)防感染。

2.2 指標(biāo)檢測與標(biāo)本處理

各組大鼠于規(guī)定時(shí)間點(diǎn)腹主動脈取血4 ml，均分為4分，分別以放射免疫法測定ET-1、TXB2、6-keto-PGF1а和AngⅡ水平。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 血漿TXB2、6-keto-PGF1а水平變化

與假手術(shù)組比較，血漿TXB2水平在造模6小時(shí)組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而在造模12小時(shí)組、造模24小時(shí)組，則明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；血漿6-keto-PGF1а水平，在各個組均較假手術(shù)組顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)，并于12小時(shí)達(dá)到最低水平，見表1。

3.2 血漿ET-1、AngⅡ水平變化

與假手術(shù)組比較，造模1小時(shí)組、造模6小時(shí)組、造模12小時(shí)組血漿ET-1水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，造模30分鐘組與造模24小時(shí)組較假手術(shù)組無明顯變化；與假手術(shù)組比較，造模30分鐘組、造模1小時(shí)組血漿AngⅡ水平顯著降低，在1小時(shí)組達(dá)到低峰，此后恢復(fù)正常水平，見表1。

表1 各組血漿TXB2、6-Keto-PGF1α、ET-1、AngⅡ水平

注：各組與假手術(shù)組比較，aP<0.05，bP<0.01

4 討論

4.1 關(guān)于“孫絡(luò)疏失”模型

“孫絡(luò)疏失”是基于“脈絡(luò)—血管系統(tǒng)病”理論提出的新概念，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，孫絡(luò)是人體絡(luò)脈的最小單位，對應(yīng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的小血管、微血管，孫絡(luò)與微循環(huán)在結(jié)構(gòu)分布、生理功能、病理變化等方面具有同一性[6]。“孫絡(luò)疏失”的病變基礎(chǔ)在微循環(huán)，“疏”指數(shù)量的減少，“失”是“疏”的進(jìn)一步加重，造成了小范圍內(nèi)的孫絡(luò)消失，同時(shí)“疏失”也指功能的缺失。大鼠冠狀動脈前降支結(jié)扎制作的心肌缺血模型，已被廣泛證實(shí)其微血管密度降低[7]，正與“孫絡(luò)疏失”相對應(yīng)，而孫絡(luò)滲灌氣血、濡養(yǎng)臟腑的功能受損，會導(dǎo)致“心主血脈”一系列正常生理功能受損，與心肌梗死后心功能各項(xiàng)指標(biāo)的異常表現(xiàn)相一致[8]。因此選擇結(jié)扎大鼠冠狀動脈前降支的方法來制作心之絡(luò)病“孫絡(luò)疏失”的大鼠模型。

4.2 “孫絡(luò)疏失”模型微血管疏縮因子的動態(tài)變化

心之絡(luò)病“孫絡(luò)絀急—孫絡(luò)疏失—孫絡(luò)瘀阻—孫絡(luò)新生”作為“脈絡(luò)—血管系統(tǒng)病”提出的孫絡(luò)病變的演變過程，與“脈絡(luò)—血管系統(tǒng)病”整體上具有一致性[9]，既往對“孫絡(luò)絀急”的研究中，已證明微血管內(nèi)皮功能紊亂是其發(fā)病基礎(chǔ)[10]，本研究在此基礎(chǔ)上繼續(xù)探討“孫絡(luò)疏失”與微血管內(nèi)皮功能紊亂的相關(guān)機(jī)制，以期為通絡(luò)藥物及應(yīng)用絡(luò)病理論治療“孫絡(luò)疏失”[11]提供更全面的機(jī)制研究，這對應(yīng)用絡(luò)病理論治療心系疾病有重要參考價(jià)值。

血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)與前列腺素I2(prostacyclin，PGI2)是生物活性完全相反的血管活性物質(zhì)，TXA2具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)血小板聚集和血管收縮作用，而PGI2是內(nèi)皮細(xì)胞合成并分泌的血管舒張因子，其主要作用是抑制血小板的黏附與聚集，拮抗TXA2，使血管擴(kuò)張。TXA2和PGI2的性質(zhì)極不穩(wěn)定，不易檢測，而其相應(yīng)的代謝產(chǎn)物TXB2和6-keto-PGF1α則較穩(wěn)定，因此測定TXB2和6-keto-PGF1α的濃度，可反映TXA2和PGI2的含量[12]。AngⅡ是腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)中最重要的活性成分，是強(qiáng)有力的內(nèi)源性血管收縮劑。其通過興奮醛固酮分泌、腎上腺髓質(zhì)及其交感神經(jīng)系統(tǒng)作用于其受體，從而發(fā)揮增加血容量及升高外周阻力的作用[13]。ET-1主要源于血管內(nèi)皮，具有很強(qiáng)的血管收縮功能，并可引起血小板聚集、促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增生[14]。

本研究結(jié)果顯示，血漿TXB2在造模6小時(shí)顯著增高，而在造模12小時(shí)、24小時(shí)則顯著下降；血漿6-keto-PGF1а在五個模型組中均顯著下降；血漿ET-1在造模1、6、12小時(shí)組顯著升高。表明“孫絡(luò)疏失”急性期血管舒張因子的變化更為明顯，提示“孫絡(luò)疏失”急性期是通過減少血管舒張因子的分泌而導(dǎo)致內(nèi)皮功能的紊亂。血漿AngⅡ在造模開始30分鐘、1小時(shí)組降低，而后回升至正常水平，這提示RAAS系統(tǒng)在“孫絡(luò)疏失”急性期尚未被激活，考慮綜合其他RAAS系統(tǒng)作用因子，進(jìn)一步研究血漿AngⅡ及RAAS系統(tǒng)在“孫絡(luò)疏失”中的作用規(guī)律及機(jī)制。以上結(jié)果表明“孫絡(luò)疏失”急性期以微血管舒縮因子動態(tài)平衡的破壞，從而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂為特點(diǎn)。

綜上所述，在心之絡(luò)病“孫絡(luò)疏失”急性期內(nèi)，并未出現(xiàn)明顯的血漿AngⅡ水平升高，而是以微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂為主要病理機(jī)制，其中微血管舒縮因子TXA2、PGI2及ET-1異常分泌，伴隨它們之間動態(tài)平衡遭到破壞，從而誘發(fā)或加重“孫絡(luò)疏失”，多種源于血管內(nèi)皮細(xì)胞的微血管調(diào)節(jié)因子在“孫絡(luò)疏失”急性期協(xié)同發(fā)揮作用，更體現(xiàn)了微血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能狀態(tài)對“心之絡(luò)病”的重要性。

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(本文編輯：蒲曉田)

DynamicalterationsofTXB2,6-keto-PGF1α,ET-1andAngⅡinmodeledratswithcoronaryarteryligation(thepatternofloosenedandweakenedminutecollateralsinthedomainofChinesemedicine):Anobservationalstudy

ZHANGJun-xiu,HUOWang,WANGPeng，etal.

TraditionalChinesemedicinedepartment,People’sLiberationArmyGeneralHospital,Beijing100853,China

YANGMing-hui,E-mail:ymh9651@sina.com

ObjectiveTo explore the way how endothelin-1(ET-1),thromboxaneB2(TXB2), 6-keto-prostaglandin1α(PGF1α) and angiotensinⅡ(AngⅡ) changes in modeled rats with coronary artery ligation (the pattern of loosened and weakened minute collaterals in the domain of Chinese medicine).MethodsA total of 60 male Sprague-Dawley rats with regular ECG performance were randomized into Sham-operation group, 30min-modeling group, a 1h-modeling group, a 6h-modeling group, a 12h-modeling group and a 24h-modeling group. The model of loosened and weakened minute collaterals in heart was established after ligation of the left anterior descending coronary artery, while the sham group was punctured without ligation. The level of plasma ET-1, TXB2, 6-Keto-PGFla and AngⅡ were detected with radioimmunoassay.ResultsCompared with the sham group,the ET-1 levels in the 1h-modeling group, the 6h- modeling group and the 12h- modeling group were significantly increased(P<0.05), then returned to nomal states at 24h. The TXB2levels were obviously increased in the 6h- modeling group(P<0.01), while decreased apparently at the 12h- modeling group and the 24h- modeling group (P<0.05). The 6-keto-PGFlα levels in all the model groups were significantly decreased (P<0.01 orP<0.05), then reached the lowest peak at 12h. The AngⅡ levels in the 30min-group and the 1h-group were obviously decreased (P<0.01 orP<0.05), then reached the low peak at 1h, while returned to nomal level in the 6h- modeling group, the 12h- modeling group and the 24h- modeling group.ConclusionsThe abnormal expression of vasomotor activity factor accompanies with the dynamic equilibrium destruction, due to the dysfunction of microvascular endothelial cell, and it exerts an important effect during the process of pathological change in acute phase of loosened and weakened minute collaterals .

Decrease of minute collaterals； Myocardial ischemia； Endothelin-1； Thromboxane B2； 6-keto-prostaglandin-Flα； AngiotensinⅡ； Rat

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(2012CB518601)

100853 北京，中國人民解放軍總醫(yī)院中醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科[張俊修(碩士研究生)、霍旺(碩士研究生)、王朋(博士研究生)、李紹旦、劉毅、楊明會]

張俊修(1988-)，2012級在讀碩士研究生。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)。E-mail:zjx6373120@126.com

楊明會(1962-)，博士，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，中華中醫(yī)藥學(xué)會副會長，解放軍中醫(yī)藥學(xué)會會長，北京中醫(yī)藥學(xué)會副會長，北京市中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會副會長。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)與臨床。E-mail:ymh9651@sina.com

R542.22

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2014.02.001

2013-12-12)