加味消渴康對糖尿病腎病大鼠肝組織細胞外基質相關調節因子表達的影響

李光超 車念聰 耿建國 王志強 郭新新 趙暉 白辰

加味消渴康對糖尿病腎病大鼠肝組織細胞外基質相關調節因子表達的影響

李光超 車念聰 耿建國 王志強 郭新新 趙暉 白辰

目的基于中醫“肝腎同源”理論，觀察加味消渴康對糖尿病腎病大鼠肝組織轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)，Smad-4蛋白(drosophila mothers against decapentaplegic protein-4)，基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)和金屬蛋白酶組織抑制劑1(tissue inhibitor of metalloproteinases-1，TIMP-1)表達的影響。方法采用單側腎切除加鏈脲佐菌素誘導的糖尿病腎病模型，將造模成功后的50只糖尿病腎病大鼠隨機分為模型組、西藥組和中藥小、中、大劑量組，每組10只，另選取10只正常大鼠作為正常對照。其中西藥組予氯沙坦(5.2 mg/kg·d)灌胃，中藥組予加味消渴康灌胃(小、中、大劑量分別為13.125 g/kg·d，26.25 g/kg·d和52.5 g/kg·d)，正常組及模型組每日灌服2 ml蒸餾水，共灌胃12周。各組大鼠于第12周末處死取出肝臟，運用ELisa法觀察大鼠肝組織TGFβ1、Smad-4、MMP-9和TIMP-1的表達。結果與正常組相比，各組大鼠肝中TGF-β1，Smad-4和TIMP-1表達明顯升高，而MMP-9的表達明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，中藥治療后，各組大鼠TGF-β1，Smad-4的表達與模型組相比明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.01)，而TIMP-1和MMP-9的表達則分別具有降低和升高的趨勢。結論加味消渴康對DN大鼠的肝損傷具有一定的保護作用。

肝腎同源； 糖尿病腎病； 肝損傷； 轉化生長因子β1； 基質金屬蛋白酶9； 金屬蛋白酶組織抑制劑-1

中醫理論認為肝與腎的關系密切，即“肝腎同源”。“肝腎同源”是指肝腎雖然有不同的結構和功能，但其起源相同,生理病理密切相關,常采用“肝腎同治”的治療法則[1]。糖尿病腎病( diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見的并發癥，其主要病因是糖尿病所致的腎小球微血管病變引起的蛋白排泄和濾過異常，其特征是細胞外基質(extracellu-lar matrix，ECM)在腎小球基底膜的積聚，導致腎小球硬化。在疾病發生發展的過程中，由轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)及其Smad蛋白(drosophila mothers against decapentaplegic protein)所組成的TGF-β/Smad通路對ECM的合成起到了重要的作用，與DN的發生發展關系密切。與此同時，在肝損傷發生時，該通路也可以發生相應的改變。研究發現，TGF-β1可以通過TGF-β/Smad通路激活肝星狀細胞，進而使肝中ECM合成增加，導致肝纖維化的發生[2]。基質金屬蛋白酶/金屬蛋白酶組織抑制劑(matrix metalloprotein-ase/tissue inhibitor of metalloproteinases，MMPs / TIMPs)在臟器纖維化的發生發展中起著重要的作用，其中MMP-9和TIMP-1則尤為重要。MMP-9主要參與ECM的降解，調節生理和病理狀態下ECM的合成和代謝平衡。而TIMP-1作為其抑制劑可以與MMP-9特異性結合，進而阻斷MMP-9的活性。研究顯示，在糖尿病腎病中，MMP-9蛋白及基因表達明顯降低，TIMP-1蛋白及基因表達明顯升高[3]。而在肝臟中，各種原因導致的肝損傷，尤其是肝纖維化，也會發生MMP-9/TIMP-1的調節失衡。研究發現，在免疫性肝纖維化大鼠中，會出現MMP-9/TIMP-1的比例失衡[4]。基于此，本實驗在中醫“肝腎同源”理論的指導下，通過觀察加味消渴康對糖尿病腎病大鼠肝組織TGF-β1，Smad-4，MMP-9和TIMP-1表達的影響，探討其對DN大鼠肝臟的保護作用，為中醫的“肝腎同源”理論提供實驗依據。

1 材料

SD雄性大鼠60只，體重160～180 g，鼠齡2～3月，購自首都醫科大學實驗動物科學部[動物的合格證號：SCXK(京)2006-0009]。加味消渴康由生黃芪10 g、山茱萸30 g、生薏苡仁30 g、水蛭6 g、葛根30 g、丹參10 g、決明子10 g組成，所需藥材購自北京祥威藥業公司；氯沙坦鉀片(購自杭州默沙東制藥有限公司，生產批號：100438)，鏈脲佐菌素(購自美國Sigma公司)，大鼠TGFβ-1ELISA試劑盒(購自上海藍基生物科技有限公司)，大鼠Smad-4 ELISA試劑盒(購自上海藍基生物科技有限公司)，大鼠MMP-9 ELISA試劑盒(購自上海藍基生物科技有限公司)；大鼠TIMP-1 ELISA試劑盒(上海藍基生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 動物模型制備及分組

本實驗采用單側腎切除加腹腔注射鏈脲佐菌素的方法制作DN大鼠模型：將造模大鼠適應性飼養1周后，行右側腎臟切除術。術后2周，禁食12小時，按50 mg/kg的劑量進行單次腹腔內注射鏈脲佐菌素。72小時后，尾靜脈采血，用穩步血糖儀測定大鼠血糖，用尿糖試紙測大鼠隨意尿糖，血糖濃度≥16.7 mmol/L，尿糖定性>+++，確定DN造模成功[5]。將造模成功的50只大鼠隨機分為模型組、氯沙坦組(5.2 mg/kg·d)、加味消渴康小劑量組(13.125 g/kg·d)、加味消渴康中劑量組(26.25 g/kg·d)、加味消渴康大劑量組(52.5 g/kg·d)灌胃，此外，另取10只大鼠作為正常對照組，每日1次，連續灌胃12周，正常組及模型組每日灌服2 ml蒸餾水。

2.2 標本采集和觀察指標檢測

各組大鼠于第12周末進行肝臟取材，每只取下150～200 mg肝組織，加入生理鹽水，肝組織重量與生理鹽水量比例為1∶7。在冰浴中制備勻漿后4℃ 3000 r離心20分鐘，取上清液0.1 ml，放入4℃冰箱備用。取出大鼠TGF-β1，Smad-4，MMP-9和TIMP-1 Elisa試劑盒，于室溫(25～30℃)放置30分鐘。取出酶標板，按照標準品的次序分別加入50 μl的標準品溶液于空白微孔中。空白微孔中加入50 μl的樣品，空白對照加入50 μl的蒸餾水。在各孔中加入100 μl的酶標記溶液(不含空白對照孔)。將酶標板用封口膠密封后，37℃孵育反映1小時(在孵育箱中保持穩定的溫度與濕度)。充分清洗酶標板5次，保持各孔有充足的水壓(濃縮洗滌液以1∶100的比例與蒸餾水稀釋)。酶標板洗滌后用吸水紙徹底拍干。各孔加入顯色劑A、B各50 μl后37℃避光反映10～15分鐘。各孔加入50 μl終止液，終止反應。

2.3 統計學處理

3 實驗結果

各組大鼠肝組織TGF-β1與Smad-4表達的測定結果見表1。

表1 各組大鼠肝組織TGF-β1，Smad-4的比較

注：與正常組相比aP<0.01，bP<0.05與模型組相比cP<0.01，dP<0.05.

與正常組相比，各組大鼠TGF-β1，Smad-4和TIMP-1的含量明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.01或P<0.05)。而MMP-9的含量明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.01)。與模型組相比，各治療組TGF-β1和Smad-4的含量明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.01或P<0.05)。而TIMP-1的表達具有降低的趨勢，MMP-9的表達則具有升高的趨勢，本實驗并未發現兩者具有統計學差異。

4 討論

“肝腎同源”是中醫的經典理論之一，它最早起源于《黃帝內經》。《素問·陰陽應象大論》云：“北方生寒，寒生水，水生咸，咸生腎，腎生骨髓，髓生肝。”本實驗在基于該理論的前提下對DN大鼠肝臟進行了相關的研究。在此，筆者主要從以下四點進行分析。

4.1 肝與腎在生理上關系密切

肝屬東方甲乙木，主疏泄，調暢氣機，調節氣血津液的代謝，疏泄情志，肝藏血，以生發為特性。腎屬北方壬癸水，主閉藏，主水，通過蒸騰氣化調節人體水液的代謝，腎藏精，主生長發育和生殖。肝腎在生理方面密切相關，首先，在五行之中，水生木，木為水之子，故肝腎為子母關系，其氣相通，肝木得到腎水的滋養才能得以維持正常的生理功能。其次，肝藏血，腎藏精，而精血同源，故肝中之血與腎中之精可以相互化生，肝血可以下達于腎以滋養腎精，使腎精化而有源；同樣肝血也有賴于腎精的滋生。與此同時，腎藏精，主骨生髓，骨中精髓與血液也可相互化生[6]，此外，肝與腎在經脈上的循行上密切相關，足厥陰肝經與足少陰腎經都循行于身體內側，并交會于“三陰交”，同時也通過奇經八脈而相互關聯，經氣互通。若肝腎的經氣不利，勢必會導致肝腎的相關功能紊亂。因此，肝腎在生理上相互依存，關系密切。

4.2 肝與腎在病理上相互影響

肝與腎不僅在生理上關系密切，通過實驗研究發現，其在病理上也相互影響。本實驗以糖尿病腎病大鼠為模型，試圖探討在大鼠腎臟發生損傷時的肝損傷情況。實驗結果顯示，模型組大鼠肝臟中的TGF-β1，Smad-4和TIMP-1的表達與正常組相比具有顯著性的升高，MMP-9的表達則具有顯著性的降低。此結果說明，從該指標的層面上來看，DN大鼠的確存在肝損傷。而在針對DN大鼠進行治療后，肝中TGF-β1與Smad-4的表達明顯下調，且TIMP-1和MMP-9也不同程度的降低和升高的趨勢。這說明在針對DN大鼠腎臟治療的同時，肝損傷也得到了一定的修復，即兩臟“一榮俱榮,一損俱損”，這與中醫的“肝腎同源”理論相符。中醫理論認為，若腎水虧竭不能涵養肝木；或肝陽過亢，劫耗腎陰；或腎精虧耗，肝血不足，最終都可以導致肝腎雙方陰血的不足，會因為“母病及子”或“子盜母氣”而引發肝腎陰虛，肝陽上亢，腎精虧虛等病理表現。基于此，筆者推斷TGF-β1/Smad通路及TIMP-1/ MMP-9對ECM代謝調節的紊亂可能也是上述中醫理論在微觀層面的體現之一，同時，該實驗也說明了肝與腎在病理上的可以相互影響。

4.3 加味消渴康對DN大鼠肝臟具有保護作用

本實驗通過選取糖尿病腎病大鼠肝臟內TGFβ1，Smad-4，MMP-9和TIMP-1進行研究，治療方藥采用了耿建國教授治療糖尿病腎病的驗方加味消渴康。該方由黃芪、山茱萸、生薏苡仁、葛根、決明子、丹參、水蛭組成，全方具有健脾益腎，祛瘀化濁的功效[7]。治療12周后，各治療組與模型組相比，TGF-β1，Smad-4和TIMP-1水平均有不同程度降低，MMP-9有一定的升高趨勢，且TGF-β1，MMP-9，TIMP-1的變化趨勢與其在腎臟中的水平變化趨勢一致[8-9]。說明加味消渴康針對DN大鼠肝中TGFβ1和Smad-4水平升高的結果，起到了正向調節作用，其通過降低肝中TGF-β1和Smad-4的表達，起到保護肝損傷的作用。由此可知，加味消渴康在針對DN大鼠腎臟治療的同時，肝損傷也得到了一定的修復，此結果也為中醫的“肝腎同源”理論相符提供了一定的實驗依據。

5 展望

研究發現，在糖尿病腎病大鼠中，肝臟也存在損傷，且針對大鼠的糖尿病腎病進行治療后，肝損傷有所減輕，這是“肝腎同源”理論在病理和治療上的具體體現。而中醫對糖尿病腎病的治法頗多，因此在下一步的研究中，可以根據不同的辨證要點，選用不同種類治法的方劑進行探討，從而可以更有效的指導臨床實踐。

“肝腎同源”的內容非常廣泛，筆者目前僅在腎損傷的同時探索肝臟的損傷情況。今后可以通過建立肝損傷的模型來探討腎臟的相關狀態，或者根據“腎主骨，生髓，通于腦”的理論來研究腦的狀態。通過對各個不同的角度的探討，“肝腎同源”理論的實驗依據將會日趨完善。

綜上所述，“肝腎同源”不僅有理論推斷，也有實驗依據，本實驗證明，兩臟可“同病”，亦可“同治”，而有關病理切片等形態學的觀察及其它指標的檢測則有待于進一步探討。

[1]李瀚旻.“肝腎同源”的理論探討[J].中國中醫基礎醫學雜志，2000，6(7)：5-9.

[2]LIANG Tie-jun，YUAN Jun-hua，TAN Yan-rong，et al.Effect of ursodeoxycholic acid on TGF beta1/Smad signaling pathway in rat hepatic stellate cells[J].Chinese Medical Journal，2009，122(10)：1209-1213.

[3]鄒大威，高彥彬，王金羊，等.通心絡對自發性2型糖尿病KK-Ay小鼠腎功能及腎組織MMP-9、TIMP-1表達的影響[J].世界中醫藥，2013，8(7)：782-786.

[4]郝瑞春，門九章，李霞，等.雄芍湯對免疫性肝纖維化大鼠MMP-9和TIMP-1的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18(16)：219-221.

[5]高蘋，賈汝漢.2型糖尿病腎病大鼠模型的建立[J].中國中西醫結合腎病雜志，2007，8(6)：316.

[6]施維.“肝腎同源”芻議[J].陜西中醫，2006，27(5)：575-577.

[7]張鋮，李鳳婷，李夢，等.加味消渴康對糖尿病腎病大鼠纖維粘連蛋白、層粘連蛋白和Ⅳ型膠原表達的影響[J].首都醫科大學學報，2012，33(4)：498-502.

[8]張鋮，李夢，李鳳婷，等.加味消渴康對糖尿病腎病大鼠絲裂原活化蛋白激酶P38及轉化生長因子-β1表達的影響[J].中醫學報，2012，27(12)：1064-1066.

[9]張鋮，李夢，李鳳婷，等.加味消渴康對糖尿病腎病大鼠MMP-9和TIMP-1表達的影響[J].中國中醫藥科技，2012，19(5)：412-413.

(本文編輯：董歷華)

TheeffectsofJiaweiXiaokekangontheexpressionsoffactorsregulatingthehepaticextracellularmatrixinDNrats

LIGuang-chao，CHENian-cong，GENGJian-guo，etal.

CollegeoftraditonalChinesemedicine，CapitalMedicalUniversity，Beijing100069，China

CHENian-cong，E-mail：cnc088@sohu.com

ObjectiveTo investigate the influence of JiaweiXiaokekang on the expression of TGF-β1, Smad-4, MMP-9 and TIMP-1 in the hepatic tissues of diabetic nephropathy (DN) rats based on the "theory of homogeny of liver and kidney".MethodsThe rat model was established by uninephrectomy and injection of streptozotocin. 50 models were divided into 5 groups: model group，western medicine group and Chinese herb medicine groups including low-dose，medial-dose and high-dose group. There were 10 models in each group. Besides, another 10 normal rats were chosen as the normal group. Western medicine group was given losartan(5.2 mg/kg·d) by intragastric administration；Chinese herb medicine gro ups were given JiaweiXiaokekang(low-dose group:13.125 g/kg·d，medial-dose group:26.25 g/kg·d and high-dose group:52.5 g/kg·d-1) by intragastric administration； The normal group and model group were fed with 2 ml distilled water daily. After 12 weeks, sacrificed all the rats and removed their hepars and then observed the expressions of TGF-β1, Smad-4, MMP-9 and TIMP-1 by immunohistochemistry.ResultsCompared with the normal group，the expression of TGF-β1，Smad-4 and TIMP-1 in other groups significantly increased，while the expression of MMP-9 significantly decreased (P<0.05 orP<0.01). After the treatment，compared with the model group，the expression of TGF-β1 and Smad-4 in other groups significantly decreased. While there was a decreased or increased trend on the expression of TIMP-1 and MMP-9 respectively.ConclusionJiaweiXiaokekang had a certain protective effect on the hepatic injury of DN rats.

Homogeny of liver and kidney； Diabetic nephropathy； Hepatic injury； Transforming growth factor-β1； Matrix metalloproteinase-9； Tissue inhibitor of metalloproteinases-1

首都中醫藥與護理研究專項(12ZHY02)

100069 首都醫科大學中醫藥學院[李光超(碩士研究生)、車念聰、耿建國、郭新新、趙暉、白辰(碩士研究生)]；北京市平谷區中醫醫院(王志強)

李光超(1986-)，2011級在讀碩士研究生。研究方向：中醫肝病的證治規律研究。E-mail：li252530538@163.com

車念聰(1957-)，本科，教授。研究方向：中醫肝病的證治規律研究。E-mail：cnc088@sohu.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2014.02.003

2013-12-03)