固定化硫酸鹽還原菌選擇性去除U(Ⅵ)的性能

唐振平，周 帥，王文濤，謝水波,2,*，高媛媛，馬華龍

(1.南華大學 污染控制與資源化技術湖南省重點實驗室，湖南 衡陽 421001；2.南華大學 鈾礦冶生物技術國防重點學科實驗室，湖南 衡陽 421001)

研究表明，在H2或乳酸鹽等電子供體存在下，硫酸鹽還原菌(SRB)可通過酶促作用直接還原/沉淀U(Ⅵ)，阻止U(Ⅵ)的遷移和擴散[5-8]。而要實現SRB生物還原/沉淀U(Ⅵ)的產業化，固定化技術的應用極為關鍵[5-7]。現有的報道多集中于游離態SRB還原U(Ⅵ)途徑和環境因子影響的探討[9-10]，但關于固定化SRB應用的研究較少；重金屬離子和含氧陰離子等共存物對U(Ⅵ)還原過程的影響已有報道[1,10]，但對有機物的影響缺乏系統研究；利用SRB去除污染物時多針對U(Ⅵ)[5,6-9]、Zn及Cu[11-15]等單一目標，有機或無機體系下U(Ⅵ)/重金屬的選擇性去除尚未見報道。

本工作擬利用聚乙烯醇和海藻酸鈉制備硫酸鹽還原菌微球，探討Zn2+和Cu2+等重金屬離子，乙酸鈉、草酸鈉和檸檬酸鈉等有機物對其還原廢水中U(Ⅵ)的影響，并考察其選擇性去除U(Ⅵ)的技術參數。

1 實驗

1.1 主要試劑與儀器

聚乙烯醇、海藻酸鈉，分析純，天津科密歐化學試劑開發中心；U3O8，分析純，國家標準物質中心(北京)，標準鈾溶液采用GBW04201方法配制。

T6型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；AA-6300型原子吸收分光光度計，日本島津公司；TG16型高速離心機，長沙英泰儀器有限責任公司；PHS-3C型pH計，上海精密科學儀器有限公司；79-1型恒溫磁力攪拌器，江蘇教育玻塑廠；HZQ-C型空氣浴恒溫振蕩器，哈爾濱東聯電子技術開發有限公司。

1.2 SRB的分離與培養

自南華大學某下水道取黑色污泥，按5 g∶1 L將污泥接種入Postgate B液體培養基，置于35 ℃振蕩培養箱中富集培養約1周。待液體培養基變黑且發出臭雞蛋味后，采用平皿壓層厭氧法對富集的SRB進行分離，即將瓊脂濃度為2%的Postgate E固體培養基倒入已滅菌且編號的培養皿(90 mm×15 mm)中，分別按10-1、10-2、10-3和10-4稀釋度吸取0.1 mL SRB富集液均勻涂布于固體培養基上。培養約3 d后，挑取內含黑色SRB菌落的瓊脂塊，采用Postgate C液體培養基對分離得到的SRB擴大培養約3 d。3次分離培養后的SRB菌體經離心(8 000 r/min，10 min)、沖洗(2.5 mg/L NaHCO3緩沖液，100 mL)后，置于盛有100 mL 2.5 mg/L NaHCO3緩沖液的150 mL血清瓶中，于4 ℃冰箱內保存。最終SRB菌懸液濃度約為35 g/L(以菌體干重計)。

1.3 固定化SRB微球的制備

將“聚乙烯醇-硫酸鈉-硼酸法”[16]進行適當改進后用于制備固定化SRB微球。分別稱取8 g聚乙烯醇和0.5 g海藻酸鈉于100 mL燒杯中，再加入無菌水75 mL，加熱至其完全溶解，冷卻至35 ℃。加入25 mL上述SRB菌懸液，攪拌約30 min至其混勻?；旌弦褐芯垡蚁┐?、海藻酸鈉和SRB最終濃度分別為8、0.5、0.875 g/mL。用注射器將此混合液滴入盛有200 mL的CaCl2(2 g/mL)和飽和硼酸(6 g/mL)溶液(交聯劑Ⅰ)的燒杯中，成球后用磁力攪拌器輕微攪動1.5 h。之后，將過濾后的微球轉移至0.5 mol/L硫酸鈉溶液(交聯劑Ⅱ)中，再用磁力攪拌器輕微攪動2.5 h，傾去硫酸鈉溶液，即得到成型的固定化SRB微球。最后，用無菌水沖洗微球2～3次，于4 ℃冰箱中保存備用。保持其他條件不變，不添加SRB菌懸液，采用以上方法制備空白微球。

1.4 實驗方法

圖1 厭氧培養裝置

在150 mL血清瓶中分別加入100 mL上述培養液，用0.1 mol/L的NaOH和0.01 mol/L的HCl調pH值至6.0，于35 ℃下振蕩培養，定時取樣分析。培養過程中不添加酵母浸膏、維生素C等營養物質，以限制SRB生長，消除U(Ⅵ)還原的干擾因素[17]；充高純氮氣和二氧化碳混合氣(V(N2)∶V(CO2)=4∶1)控制厭氧條件。

1) 固定化SRB還原U(Ⅵ)的單因素實驗

初始pH值影響實驗：pH值設為2.0～6.0，設置梯度為1.0。

微球投加量影響實驗：通過微球投加量控制菌體量(每g微球約含0.071 g SRB，以干菌計)，微球投加量設為3～7 g，設置梯度為1 g。

2) 共存污染物對固定化SRB還原U(Ⅵ)的影響實驗

Zn2+和Cu2+濃度對U(Ⅵ)還原的影響實驗：分別加入25、50、100、120、140、150 mg/L Zn2+或Cu2+，以無外加重金屬離子試樣液為空白對照。

有機物對U(Ⅵ)還原的影響實驗：分別加入10 mmol/L乙酸鈉、草酸鈉以及檸檬酸鈉3種有機物，以無外加有機物作為空白對照。

3) 固定化SRB選擇性去除U(Ⅵ)實驗

間接選擇性去除U(Ⅵ)實驗：分別加入50 mg/L Zn2+、50 mg/L Cu2+及10 mmol/L檸檬酸鈉。

1.5 分析方法

2 實驗結果與討論

2.1 固定化SRB還原U(Ⅵ)的實驗結果

1) 初始pH值對固定化SRB還原U(Ⅵ)的影響

初始pH值對U(Ⅵ)去除率的影響示于圖2。由圖2可看出，初始pH值為2.0時，96 h內U(Ⅵ)去除率始終低于20%；隨著初始pH值的升高，固定化SRB對U(Ⅵ)的還原能力增強，當初始pH值從2.0升至6.0時，實驗96 h后U(Ⅵ)去除率從17.65%上升到94.76%。當初始pH值為3.0～6.0時，U(Ⅵ)的生物還原過程主要發生在前24 h內。

圖2 初始pH值對U(Ⅵ)去除的影響

本課題組[1]曾探討了初始鈾濃度20 mg/L、溫度35 ℃條件下pH值對游離態SRB還原U(Ⅵ)的影響。結果表明，當pH值為2.0或3.0時，6 d后U(Ⅵ)去除率均低于10%；當pH=6.0時，6 d后血清瓶中U(Ⅵ)幾乎全部被還原。可見，在近中性環境中，SRB固定前后還原U(Ⅵ)的能力均較強；SRB經固定化后對低pH值的緩沖作用有所增強。這主要是由于大量SRB菌體被包裹在微球內部，削弱了強酸性環境對其還原酶體系生物學活性的抑制作用，同時降低了H+和U(Ⅵ)對SRB細胞壁上有限負電性活性部位的競爭，從而維持了其對U(Ⅵ)的還原能力[1]。為維持U(Ⅵ)的高效還原，后續實驗均選擇pH值為6.0。

2) 微球投加量對固定化SRB還原U(Ⅵ)的影響

微球投加量對固定化SRB還原U(Ⅵ)的影響實驗結果示于圖3，空白微球在24 h內對U(Ⅵ)的去除情況示于圖4。分析圖3可知，pH值為6.0時，U(Ⅵ)的去除主要在于微生物的活動，且發生在前24 h內。這是由于初始階段電子供體充足，微生物代謝活動旺盛，U(Ⅵ)還原率增大顯著；24 h后隨電子供體的消耗，U(Ⅵ)還原率的增大趨于平緩。當微球投加量為6 g/L(相當于菌體投加量0.42 g/L)時，48 h內U(Ⅵ)還原率高達94.57%。超過該值，U(Ⅵ)還原效率隨微球投加量的增加變化不大。這說明，對于U(Ⅵ)濃度為15 mg/L的溶液，6 g/L微球投加量已足夠。此外，由圖4可看出，空白微球對U(Ⅵ)也有一定的吸附作用，這可能與微球的多孔結構有關[18]。

圖3 微球投加量對U(Ⅵ)去除的影響

圖4 空白微球投加量對U(Ⅵ)去除的影響

2.2 共存污染物對固定化SRB還原U(Ⅵ)的影響

1) 重金屬離子對固定化SRB還原U(Ⅵ)的影響

圖5、6分別為不同Zn2+和Cu2+濃度下，固定化SRB還原U(Ⅵ)的情況。從圖5、6可知，當初始Zn2+或Cu2+濃度在25～120 mg/L范圍時，U(Ⅵ)還原動力學曲線與空白對照組差異較小，在96 h后U(Ⅵ)去除率可達94%左右，說明Zn2+或Cu2+濃度在0～120 mg/L范圍內對U(Ⅵ)的還原影響很小。當初始Zn2+或Cu2+濃度升高至140 mg/L時，U(Ⅵ)還原受到不同程度的抑制，而當其達到150 mg/L時，U(Ⅵ)濃度在初期稍有下降，隨后保持穩定，表明U(Ⅵ)還原受到完全抑制。實驗中發現，96 h后開啟初始Zn2+或Cu2+濃度分別為25、50、100、120 mg/L和空白組血清瓶，均有較濃的臭雞蛋味氣體產生，且部分微球變黑。而初始Zn2+或Cu2+濃度為150 mg/L時，血清瓶中并未出現這兩種現象。由此推斷，Zn2+或Cu2+對SRB的毒閥值約為150 mg/L。Azabou等[11]和Jalali等[12]研究發現，Zn2+或Cu2+濃度高于150 mg/L時，對SRB具有致死作用，這與本實驗結果基本一致。

圖5 Zn2+濃度對U(Ⅵ)去除的影響

圖6 Cu2+濃度對U(Ⅵ)去除的影響

重金屬對SRB還原U(Ⅵ)的影響主要表現在其對SRB的毒害作用。Garcia等[14]研究表明，pH=7.0，Cu2+濃度為25、50、100 mg/L時，接種SRB 21 d后，Cu2+去除率高達99%，且產生黑色沉淀；當Cu2+濃度增至200 mg/L時，細菌未見生長。Kieu等[13]在探討半連續攪拌槽反應器中SRB對重金屬離子的去除效果時也得到了類似結論。Utgikar等[15]則報道，Zn2+和Cu2+對SRB的毒閥值分別為12 mg/L和20 mg/L。本課題組[1]早期在研究Zn2+和Cu2+對U(Ⅵ)還原的影響時也發現，Zn2+和Cu2+抑制閥濃度分別為15 mg/L和25 mg/L。究其原因主要在于，重金屬對SRB的毒閥值和抑制程度受環境影響(如細胞周圍的物化環境、SRB種系組成及生物反應器構建情況等)較大[13]。此外，大量研究[16,18]表明，微生物經包埋固定可有效緩沖重金屬離子的沖擊作用，這也可能是本實驗中Zn2+和Cu2+濃度毒閥值偏高的原因之一。

2) 有機物對固定化SRB還原U(Ⅵ)的影響

實驗中，分別以乙酸鈉、草酸鈉和檸檬酸鈉為研究對象，考察其對固定化SRB還原U(Ⅵ)的影響。實驗結果示于圖7。由圖7可看出，草酸鈉和檸檬酸鈉對U(Ⅵ)的還原存在不同程度的抑制作用，乙酸鈉的影響較小。24 h內，與空白對照組相比，乙酸鈉使U(Ⅵ)去除率升高約3%，而草酸鈉和檸檬酸鈉分別使U(Ⅵ)去除率降低約61%、76%。

圖7 有機物對U(Ⅵ)去除的影響

Ganesh等[19]通過在有機物存在條件下降解硫代硫酸鹽的實驗證實，有機物對U(Ⅵ)還原過程的影響差異不在于有機物對SRB產生的不同毒性。此外，在考察有機物對脫硫弧菌還原U(Ⅵ)的影響時還發現，乙酸鈉、草酸鈉和檸檬酸鈉等有機物濃度均未顯著降低，進而說明U(Ⅵ)還原趨勢的差異也不在于SRB對有機物的選擇性降解。結合上述分析及表1可知，有機物對固定化SRB還原U(Ⅵ)的影響差異主要在于有機配體的不同絡合能力(檸檬酸鈉>草酸鈉>乙酸鈉)。由于多齒配體有機物可與U(Ⅵ)絡合，限制了U(Ⅵ)的還原[20]。

2.3 固定化SRB選擇性去除U(Ⅵ)實驗

SRB除通過酶促作用直接還原U(Ⅵ)外，還可利用代謝產物間接沉淀重金屬[13,21]，兩種機制示于圖8。由于這兩種機制是互斥的，適當優化處理條件有可能實現鈾的選擇性沉淀，這對于修復鈾污染和回收鈾資源具有現實意義。

a——乳酸氧化過程；b——SRB通過酶促作用直接去除U(Ⅵ)的過程；c、d——SRB利用代謝產物沉淀去除重金屬的過程

1) 固定化SRB直接選擇性去除U(Ⅵ)實驗

圖9 固定化SRB直接選擇性去除U(Ⅵ)

表1 有機配體類型及絡合特性[19]

2) 固定化SRB間接選擇性去除U(Ⅵ)實驗

圖10 固定化SRB間接選擇性去除U(Ⅵ)

在檸檬酸鈉存在情況下，Zn2+、Cu2+及U(Ⅵ)的去除實驗結果示于圖10。從圖10可看出，在72 h內，Zn2+和Cu2+的去除率分別達到97.54%、95.48%，而U(Ⅵ)的去除率僅為12.07%。可見，通過引入檸檬酸鈉，有利于重金屬離子(Zn2+和Cu2+)的選擇性沉淀。究其原因，U(Ⅵ)可與有機物形成可溶性絡合物，而金屬硫化物不具備這一性質[19]。結合前述分析可知，適當添加有機物有利于選擇性沉淀重金屬。當多齒配體有機官能團通過生物或光降解后[25]，可利用直接法進一步還原/沉淀去除U(Ⅵ)。

3 結論

1) 在U(Ⅵ)還原過程中，硫酸鹽還原菌經聚乙烯醇和海藻酸鈉固定后對pH值的緩沖能力顯著增強。當pH值為3.0～6.0時，固定硫酸鹽還原菌可高效、穩定地還原/沉淀U(Ⅵ)。在U(Ⅵ)濃度為15 mg/L、微球投加量為6.0 g/L及溫度為35 ℃的條件下，反應96 h后U(Ⅵ)去除率達到94.67%。

2) 當Zn2+或Cu2+濃度低于100 mg/L時，U(Ⅵ)還原未受顯著影響；而當Zn2+或Cu2+濃度增至150 mg/L時，U(Ⅵ)還原被完全抑制。

3) 乙酸鈉、草酸鈉和檸檬酸鈉3種有機物對固定化硫酸鹽還原菌還原U(Ⅵ)的影響存在較大差異。當乙酸鈉等單齒配體有機物存在時，U(Ⅵ)可被完全還原，而多齒配體有機物(草酸鈉和檸檬酸鈉)存在時，會延緩甚至抑制U(Ⅵ)的還原。

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