舒血寧聯合奧曲肽對急性壞死性胰腺炎大鼠腦損傷的保護作用

王小紅 魏榮龍 儲磊 胡江鴻 沈云志

重癥急性胰腺炎(SAP)并發腦損傷，又稱胰性腦病(pancreatic encephalopathy，PE)，是SAP常見的并發癥之一，主要表現為定向力障礙、意識模糊、幻覺等精神狀態異常。臨床SAP并發PE約占同期患者的18.2%，病死率達67.0%。

目前PE的發病機制尚未完全清楚，而胰酶作用學說及炎癥遞質作用學說得到廣泛關注[1]。本研究應用舒血寧及奧曲肽治療急性壞死性胰腺炎(ANP)并發腦損傷大鼠，觀察兩者聯合的療效，探討其可能的作用機制。

一、資料與方法

1．實驗動物及分組：健康雄性遠交系大鼠180只，體質量250～305 g，鼠齡43～49 d，購自南通大學醫學院實驗動物中心。應用隨機數字表法分為對照組、ANP組、舒血寧組、奧曲肽組、舒血寧和奧曲肽聯合處理(聯合)組及陽性對照的烏司他丁組，每組30只。牛磺膽酸鈉(95%)購自Sigma公司；舒血寧為石家莊神威藥業有限公司產品，國藥準字號Z13020795；奧曲肽為瑞士諾華制藥有限公司產品，國藥準字號H20090924；烏司他丁為廣東天普生化醫藥股份有限公司產品，國藥準字號H19990132。參照Kaplan等[2]方法采用胰膽管逆行注入5%牛磺膽酸鈉0.1 ml/100 g體質量方法制備大鼠ANP并發腦損傷模型。造模后6 h，舒血寧組大鼠經股靜脈注射舒血寧0.5 ml/100 g體質量(配方：5%葡萄糖液250 ml+舒血寧注射液20 ml+普通胰島素3U)，每日1次；奧曲肽組皮下注射奧曲肽0.5 μg/100 g體質量，每6 h 1次；聯合組分別給予舒血寧0.5 ml/100 g體質量，每日1次，奧曲肽0.5 μg/100 g體質量，每6 h 1次(不混合)；烏司他丁組給予靜脈注射烏司他丁1 ml/100 g體質量(配方：0.9%氯化鈉500 ml+烏司他丁10萬U)，每8 h 1次。對照組開腹輕觸摸胰腺后關腹，術后6 h給予等容積生理鹽水，每天1次。

給藥后即刻(造模后6 h)、造模后24 h分兩批處死各組大鼠，腹主動脈取血，分離血清，置-20℃冰箱保存，取胰腺組織，乙醛固定，取腦組織，液氮冷凍保存。

2．血清磷脂酶A2(PLA2)、TNF-α、IL-6含量測定：采用陳氏法[3]測定PLA2，采用放射免疫法檢測TNF-α、IL-6含量。TNF-α、IL-6放免試劑盒購自南京建成生物工程研究所，嚴格按試劑盒說明進行操作。

3．胰腺病理學檢查：胰腺組織常規固定、石蠟包埋、切片、HE染色，由專科醫師盲法在光鏡下閱片，并參照Schmidt等[4]標準進行病理評分。

4．腦組織含水量測定：從液氮中取出后稱腦濕重，然后置于真空恒溫干燥箱100℃烘烤24 h。稱干重，計算腦組織含水量。腦組織含水量=[(濕重-干重)/濕重]×100%。

5．腦組織病理學及電鏡檢查：取部分新鮮腦組織，常規行病理學檢查，由專科醫師盲法在光鏡下閱片，參照孔雷等[5]方法進行病理評分。腦組織電鏡標本制作及觀察由南通大學神經再生重點實驗室專業老師指導進行。

6．腦組織TNF-α、IL-6 mRNA檢測：采用RT-PCR法檢測。TNF-α、IL-6及內參GAPDH的PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設計并合成。引物序列：TNF-α 正義為 5′-CGCCACCGGCAAGGATTCCA-3′，反義為5′-TCCCAACGCTGGGTCCTCCA-3′，產物335 bp；IL-6正義為5′-CAAGAGACTTCCAGCCAGTTGC-3′，反義為5′-TTGCCGAGTAGACCTCATAGTGACC-3′，產物614 bp；內參GAPDH正義為5′-CCTGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，反義為5′-GCCAGTGAGCTTCCCGTTCAGC-3′，產物239 bp。PCR反應條件：95℃ 5 min，95℃ 20 s、55℃ 30 s、72℃ 40 s，循環35次，再72℃延伸7 min。擴增產物經電泳分離，用凝膠成像儀掃描，Image J軟件分析，以目的條帶與內參條帶的灰度值比表示mRNA相對表達量。

二、結果

1．大鼠存活率：各組大鼠6 h內均無死亡。24 h時ANP組9只死亡，存活率40%；舒血寧組7只死亡，存活率53.3%；奧曲肽組6只死亡，存活率60%；聯合組3只死亡，存活率80%；烏司他丁組5只死亡，存活率66.7%。其中聯合組與ANP組24 h存活率的差異有統計學意義(P=0.0302)。

2．血清PLA2、TNF-α、IL-6水平及腦組織含水量、TNF-α和IL-6 mRNA表達量：各實驗組6、24 h時血清PLA2、TNF-α、IL-6水平，腦組織含水量，TNF-α、IL-6 mRNA表達量均較同時間點對照組顯著升高，差異具有統計學意義(P值均<0.01)。然而，各實驗組6 h點的各指標差異無統計學意義，而24 h時舒血寧組、奧曲肽組、聯合組、烏司他丁組各指標均較ANP組顯著下降，其中聯合組又較舒血寧組、奧曲肽組、烏司他丁組顯著降低，差異均具有統計學意義(P<0.05，表1，圖1)。

表1 各組各項檢測指標比較

3．胰腺病理、腦組織病理及超微結構變化：ANP組6 h時鏡下見胰腺腺泡水腫，脂肪液化，間質顯著增寬，小葉間隙增大，炎癥細胞浸潤，胰腺局灶或片狀出血壞死，24 h時胰腺破壞更嚴重，大量腺泡消失，出血壞死區域擴大，殘存部分小葉組織(圖2)。6 h時鏡下見腦組織內多處神經元細胞水腫，氣球樣變，小血管和毛細血管充血，多灶性毛細管擴張及出血，血管周圍水腫，間質炎癥細胞浸潤，微血管內白細胞聚集及附壁，24 h時損傷更明顯(圖3)；透射電鏡下見腦神經元的染色質邊集，核仁消失，胞質水腫，細胞內容減少，線粒體腫脹，空泡變性，核膜破裂，間質水腫和程度不等的脫髓鞘改變,24h時的病理改變更明顯(圖4、5)。

討論本研究結果顯示，ANP組6 h時胰腺組織及腦組織均出現病理損傷，腦組織含水量增加，提示存在腦損傷，表明ANP并發腦損傷的模型成功建立。

圖1 6、24 h時ANP組(1,2)、舒血寧組(3,4)、奧曲肽組(5，6)、聯合組(7,8)、烏司他丁組(9,10)、對照組(11,12)大鼠腦組織TNF-α、IL-6 mRNA的表達

圖2 ANP組6(a)、24 h(b)的大鼠胰腺組織病理改變(HE ×400)

圖3 ANP組6(a)、24 h(b)的大鼠腦組織病理改變(HE ×200)

圖4 ANP組6(a)、24 h(b)的大鼠腦皮質超微結構改變(×10000)

圖5 ANP組6(a)、24 h(b)的大鼠腦皮質超微結構改變(×15000)

文獻報道[6-10]，PLA2、TNF-α及IL-6等因子與ANP相關性腦損傷密切相關。本研究結果顯示，ANP組大鼠血清PLA2、TNF-α、IL-6水平、腦組織TNF-α、IL-6 mRNA表達量隨著時間的延長均逐漸增加，提示PLA2、TNF-α及IL-6均參與ANP相關性腦損傷的發生和發展，與文獻報道的結果一致。

舒血寧注射液是第四代的銀杏葉提取物，主要有效成分為黃酮苷類和萜烯內酯類活性物質。現代藥理證明，舒血寧注射液能減輕全身炎癥反應綜合征(SIRS)時多器官的缺血再灌注損傷，清除自由基、拮抗血小板活化因子、抑制白細胞活化，減輕炎癥反應的發生、發展，起到保護多臟器功能的作用[11]。奧曲肽是一種人工合成的八肽環狀化合物，具有與天然內源性生長抑素類似的作用，但作用較強且持久，半衰期較天然生長抑素長30倍。奧曲肽具有抑制胰腺外分泌，減少胰酶含量；松弛Oddi括約肌，保持胰液引流通暢；抑制細胞因子的生成和炎癥介質的釋放，并通過刺激網狀內皮系統而減輕內毒素血癥，抑制炎癥反應等作用[12]。本研究結果顯示，舒血寧組及奧曲肽組與陽性對照的烏司他丁組一樣，均能降低ANP大鼠血清PLA2、TNF-α、IL-6水平、腦組織含水量及TNF-α、IL-6 mRNA表達量，減輕胰腺及腦組織的病理損傷。聯合應用舒血寧及奧曲肽的作用較單獨用藥的作用更顯著，值得在臨床進一步推廣應用。

參 考 文 獻

[1] 蔣曉蕓,戎蘭,蔣義斌,等. 胰腺炎并發胰性腦病37例臨床分析[J]. 胰腺病學,2006,6(3): 148-150.

[2] Kaplan O, Kaplan D, Casif E, et al. Effects of delayed administration of octreotide in acute experimental pancreatitis[J]. J Surg Res,1996,62(1):109-117.

[3] 陳思鋒,吳中立.體液和組織磷脂酶A2簡便快速測定法[J].第二軍醫大學學報, 1989,10(3):254-256.

[4] Schmidt J, Rattner DW, Lewandrowski K, et al. A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy[J]. Ann Surg,1992,215(1):44-56.

[5] 孔雷,韓天權,于穎彥,等. 胰酶、細胞因子、高滲液和感染對大鼠腦損傷的形態學研究[J].胰腺病學,2004,4(2):98-101.

[6] 王鳳蓮.胰性腦病發病機制及診治進展[J]. 醫學理論與實踐,2012,25 (16): 1982-1984.

[7] Lopez-Font I，Gea-Sorlí S，de-Madaria E，et al．Pancreatic and pulmonary mast cells activation during experimental acute pancreatitis[J]．World J Gastroenterol，2010,16(27): 3411-3417.

[8] Tian H, Zhang X, Wu C, et al. Effects of Baicalin and Octreotide on the serum TNF-alpha level and apoptosis in multiple organs of rats with severe acute pancreatitis[J]. Inflammation, 2009, 32(3): 191-201.

[9] Novovic S, Andersen AM, Ersboll AK, et al. Proinflammatory cytokines in alcohol or gallstone induced acute pancreatitis. A prospective study[J]. JOP, 2009, 10(3): 256-262.

[10] Jiang CF, Shiau YC, Ng KW, et al. Serum interleukin-6, tumor necrosis factor alpha and C-reactive protein in early prediction of severity of acute pancreatitis[J]. J Chin Med Assoc, 2004,67(9):442-446.

[11] 謝咪雪,蔣琦,陳冬兒,等.銀杏葉提取物對心肌缺血再灌注損傷保護作用的研究進展[J]. 浙江中醫藥大學學報,2012,36(2):230-232.

[12] Zhang XP, Zhang L, Yang P, et al. Protective effects of baicalin and octreotide on multiple organ injury in severe acute pancreatitis[J]. Dig Dis Sci,2008, 53(2): 581-591.